凝集カセットのアレリック交換変異誘発は、遺伝子欠失が遺伝子産物の機能を理解するために利用できる貴重なツールであるため、重要な方法です。この技術の主な利点は、下流の遺伝子に極性効果を与えることなく標的遺伝子欠失を可能にすることです。5つの素数および3つの相同性組換え用の主要相同性アームとして機能する欠失をターゲットとする遺伝子の約3キロベース領域を直接上流および下流に特定し、テキストプロトコルに示すようにプライマーを割り当てます。
1つまたは2つの反応で、抽出したばかりのクラミジアゲノムDNAから3キロベース5素数および3つのプライムホモロジーアームを増幅し、後のDNAアセンブリに十分な断片を生成します。テキストプロトコルに記載されているPCR断片を精製し濃縮した後、製造業者のプロトコルに従って1つのセル1単位とSBF1単位の20マイクロリットル反応で500ナノグラムのpSUmC-4.0ベクターを消化する。消化および精製されたpSUmC-4.0ベクターと5つの素数および3つの主要相同性アームPCR産物を、各ホモロジーアームの0.01ピコモールベクターと0.09ピコモールの比で組み合わせます。
メーカーのプロトコルに従ってDNAアセンブリ反応で断片を組み立てます。DNAアセンブリ反応の1マイクロリットルで50マイクロリットルの電気コンビニテント大腸菌を変換します。変換された大腸菌を1ミリリットルスペクトルマイシンあたり100マイクログラムを含むLB寒天プレートにプレートします。
一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、蛍光反転顕微鏡を用いた緑色および赤色蛍光のコロニーをスクリーニングする。寒天プレートあたり合計5〜30コロニーが期待されています。
選択したコロニーの一晩の液体培養インキュベーションに続いて、各挿入を増幅するPCRスクリーニングプライマーを用いてベクターに各相同性アームの挿入を確認する。種子マッコイ細胞は、典型的には、テキストプロトコルに記載されているように2つの6ウェルプレートにクラミジアを培養するために使用されるマウス線維芽細胞である。1.5ミリリットルチューブに、C.トラコマティス野生型血清膜L2素体、または2のMOIで6ウェルプレートの12の井戸に感染するのに十分な量で、EBを追加します。
20,000グラムを超えるべきエブを30分間ペレットし、上清を捨てます。600マイクロリットルの塩化カルシウムバッファーで、EB を穏やかに再懸濁させることによりクラミジア変換を開始します。次に、12マイクログラムのpSUmC-4.0と相同性アームをチューブに加え、フリックして溶液を軽く混ぜます。
10分ごとに混合するためにフリック30分間室温でチューブをインキュベートします。24ミリリットルのHBSSに変換液を加え、穏やかにピペットで混ぜます。6ウェルプレートのコンフルエントマッコイ細胞の各ウェルに接種物の2ミリリットルを移す。
摂氏20度で1時間900回gの遠心分離で感染する。接種を取り除き、ウェルRPMI成長培地番号2あたり2ミリリットルに置き換えます。5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。
最低7時間のうち12時間を超え、選択メディア番号1のウェルあたり2ミリリットルに交換してください。感染時から48時間、摂氏37度でインキュベーションを続ける。収穫し、マッコイの細胞の新鮮な単層に細菌を通過させる細胞スクレーパーを使用して穏やかにマッコイ単層を掻き取り、細胞を媒体に持ち上げます。
各ウェルから2ミリリットルのチューブに材料を移します。セル材料を20,000グラムより大きいマイクロ遠心分離機で摂氏4度で30分間ペレットする。上清を捨て、HBSSの1ミリリットルの細胞ペレットを穏やかにピペット処理して再懸濁する。
セルデブリを摂氏4度で5分間200倍にする。上清をコンフルエントマッコイ細胞の新鮮な井戸に移します。各ウェルにHBSSを1ミリリットル追加し、井戸当たり2ミリリットルの総体積を加えます。
摂氏20度で1時間900回gの遠心分離で感染する。接種を感染直後の選択メディア番号1に置き換えます。感染後24時間の蛍光逆顕微鏡を使用して赤と緑の含み物が検出されるまで、48時間ごとにマッコイ細胞の新鮮な単層に細菌を渡し続けます。
赤と緑のインクルージョンが検出されたら、選択メディアナンバー2を使用する前と同様に、単層を通過し続けます。pSUmC-4.0ベクターの喪失およびloxP選択カセットのゲノムへの組み込みを示す、感染後24時間に緑色のみの封入が検出されるまで、単層を通過し続ける。SPGでグリーンのみのインクルージョンを収穫し、凍結します。
0.5 ~ 1.0 の MOI に、緑色のみの包含を強化し、テキストに記述されているように、モノレイヤーを SPG に収穫します。1.5ミリリットルチューブで50マイクロリットルのアリコートを取得し、マイナス80°Cで凍結します。テキストプロトコルに記載されているように、384ウェル組織培養プレートにマッコイ細胞をシードします。
HBSSの緑色のみの細菌のアリコートを希釈して、20ミリリットルあたり約50個のEBを達成する。希釈した接種を貯留トレイに移します。コンフルエントマッコイ細胞の384ウェルプレートからメディアを取り除き、プレート全体を逆さまにして廃棄物容器に引き上げます。
マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50マイクロリットルのC.トラコマティス接種を加えます。摂氏20度で1時間900回gの遠心分離で感染する。フリックで接種を取り除き、成長培地番号2のウェルあたり50マイクロリットルに交換します。
5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。プレートを5~12日間インキュベートした後、蛍光反転顕微鏡または高含有スクリーニングプラットフォームを使用して緑色蛍光インクルージョンを備えた個々のウェルを同定します。P10チップで単層を削ることによって、緑色のみのインクルージョンで井戸を収穫します。
ウェルの内容物全体を2ミリリットルのHBSSを含むチューブに移します。2ミリリットルの接種物を6ウェルプレートの新鮮なコンフルエントマッコイ単層に穏やかに混合して塗布します。クローナル集団を豊かにし、凍結し、そして、そして、
定量PCRを用いて、クローン分離C.トラコマティスからの標的遺伝子の欠失を確認します。クローン分離されたC.trachomatis FRAEM変異体、pSU-Creベクター、および選択媒体番号3を用いて変換プロセスを繰り返す。選択カセットの喪失を示す赤色のみの封入物が検出されるまで単層を通過する。
クローン的に以前のように384ウェルプレートの希釈を制限することによって、赤のみの封入を分離します。MOIが0.1になるまで渡すことでクローン集団を豊かにする。濃縮されたら、pSU-Cre ベクターの損失を開始するには、選択メディアを成長培地番号 2 に置き換えます。
クローン的に以前のように非蛍光細菌を単離する。しかし、手動でプレートをブライトフィールド顕微鏡でスキャンして、インクルージョンを検出します。細菌を豊かにし、凍結する。
変異株のスクリーニングは、定量的リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティング、および全ゲノムDNAシーケンシングを使用して、前述したとおりである。代表的なデータは、tmeAが遺伝子欠失の対象となっているものを示している。C.トラコマティスtmeaA欠失株はFRAEMを使用して生成され、C.トラコマティスtmeA-lx株はFLAEMを使用して生成されます。
tmeAおよび下流tmeBの相対DNAコピー数、pSUmC-4.0選択カセットに含まれるgfp、およびpSU-Creベクターに含まれるcreが全て示されている。両方の変異株は、tmeA遺伝子座の欠失を含む。しかしながら、tmeA-lxはgfp DNAの存在しないことによって示される選択カセットを含んでいない。
tmeA変異株は、mRNAおよびタンパク質レベルによって示されるようにtmeBの発現を低下させた。FLAEMを使用してtmeA-lx変異株を生成すると、tmeBの発現はmRNAおよびタンパク質レベルによって検出されたように復元されます。相同性の腕を用いたpSUmCベクターの慎重な構築は、遺伝子の標的欠失に不可欠である。
クラミジア変換の前に、正確なベクターアセンブリを確保するために時間を取る必要があります。FLAEMは、研究を混乱させる可能性のあるオフターゲット遺伝子の発現を低下させることなく、特定の遺伝子を研究し、標的を絞った欠失を行うツールを研究者に提供してきました。FLAEMによって生成されたC.トラコマティス欠失変異体は、発生および病原的メカニズムを含むクラミジア生物学の様々な側面を研究するために利用することができる。
