Dieses Protokoll ermöglicht es, Samen intakt zu schneiden, damit sie nicht zerbröckeln, was die Visualisierung von Stärkegranulat in jedem Samen ermöglicht, der in eine Pipettenspitze passt. Der formbare Kunststoffkegel unterstützt die native Struktur der trockenen Gewebe und Organe, so dass dieser billige und einfache Verteiler es ermöglicht, viele Proben in kurzer Zeit zu verarbeiten. Um von dem forensischen Mikroskopievorteil hier fortzufahren, resistente Stärke, etwas, nach dem wir alle suchen, Zugänglichkeit von Enzymen zu dieser rohen Stärke, Amylolyse, glykämischer Index und Glukosespitzen, das sind Kernparameter für die Züchtung besserer Reissorten, um Typ-2-Diabetes auf der ganzen Welt zu bekämpfen heute.
Und jetzt ist es mir eine große Freude, Ihnen Dr. Kiah Barton vorzustellen. Dr. Barton kommt aus unserem Labor und wird die Kernbildgebungseinrichtung der Fakultät nutzen, um Ihnen zu zeigen, wie diese Technik eingesetzt wird. Beginnen Sie mit dem Enthäuten der trockenen Kerne.
Legen Sie einen einzelnen Kern auf einen flachen Gummistopfen auf einer Werkbank und stellen Sie sicher, dass dieser Stopfen stationär bleibt. Verwenden Sie einen zweiten flachen Gummistopfen, um den Kern abzuschleifen, indem Sie ihn gegen den ersten Gummistopfen drehen, entfernen Sie dann die Schalen aus dem Kern, achten Sie darauf, das Endosperm nicht zu zerbrechen oder die Samen zu aggressiv zwischen den beiden Gummispännen zu mahlen. Entfernen Sie alle verbleibenden Schalen mit einer feinen Pinzette und führen Sie einen einzelnen geschälten Kern in eine 250-Mikroliter-Pipettenspitze aus Kunststoff ein.
Stellen Sie sicher, dass das Embryonenende des Kerns zum konischen Ende der Pipettenspitze zeigt. Setzen Sie eine zweite 250-Mikroliter-Pipettenspitze ein, um den Kern in die erste Pipettenspitze zu drücken und den Kern während des Schneidens unbeweglich zu halten, wobei darauf zu achten ist, dass der Kern nicht beschädigt oder die zweite Pipettenspitze gebogen wird. Legen Sie die Pipettenspitzen-Assemblage flach auf eine Werkbank und halten Sie sie von Hand fest.
Verwenden Sie mit der anderen Hand eine scharfe Skalpellklinge, um durch die Mitte des Kerns zu schneiden und das Ende der Pipettenspitze abzuschneiden. Schneiden Sie durch die Assemblage nach unten und richten Sie dann die Skalpellklinge vertikal aus, so dass die beiden neuen freiliegenden Flächen des Handabschnitts parallel sind. Schneiden Sie dann mit dem Skalpell einen Millimeter dicke Abschnitte des Reiskorns ab.
Um eine Reflexionslichtmikroskopie durchzuführen, legen Sie die quer verlaufenden Reisabschnitte auf ein Stück schweres schwarzes Papier. Erhalten Sie Lichtbilder der Querschnitte mit einem Stereomikroskop mit montierten Schwanenhälsen für schräge Beleuchtung mit mindestens 10-facher Vergrößerung. Wildtyp-Nipponbare- und ssg1-Abschnitte wurden unter 260-mal, 920-mal und 4.200-fachen Vergrößerungen untersucht.
Bei richtiger Zubereitung waren die Reisabschnitte etwa 0,9 Millimeter dick mit minimaler Zersplitterung des Endosperms und intakten Perikarp- und Aleuronschichten. Diese Technik ermöglicht die Herstellung von Abschnitten von ausreichender Qualität, um die gesamte Endospermzelle, das zusammengesetzte Stärkegranulat und einzelne Subgranulate zu beobachten. Transluzente Kernproduzenten, wie die wildtypresistente Stärkehybridlinie Zhehui 7954 und die kobaltgenerierte Mutante RS111, produzierten dicht gepackte polyedrische Stärkegranulate, was der normale Reisendosperm-Phänotyp ist.
Die REM-Bilder von Kalkkernproduzenten, der kommerziellen Sorte Ye Tang und RS4, zeigten Stärkegranulate, die rund und lose verpackt waren. Der Wildtyp Xiushiu 11 und seine Mutante KMD1, die das Cry1Ab-Gen zur Hemmung der Insektenprädation exprimierten, hatten Abschnitte und Endosperm-Morphotypen, die den transluzenten resistenten Stärkelinien ähnelten. Diese Technik kann auf Samen anderer Arten angewendet werden.
Das Modell-Monokotyledon, Brachypodium distachyon, produziert sehr harte Samen, aber es war immer noch möglich, einen intakten Querschnitt zu erhalten. Intakte Querteile wurden auch aus weichem, weißem Winterweizen hergestellt. Diese schnelle, kostengünstige Screening-Methode für den Blick in biologische Strukturen kann auf Insektenbeine, Johannisbrotbaumspitzen, Weißdorn, Fischstacheln oder jedes Feld der forensischen Mikroskopie angewendet werden, das von diesem Probenunterstützungsaufbau profitieren kann.
Nach Durchführung dieses Protokolls sind die Sputterbeschichtung für die Elektromikroskopie, die Färbung mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen und das Auftragen von Calcafluor auf die Färbung für eine Beta-Glucan-Zellwanddicke in mutierten Hafer- und Gerstenlinien einige schnelle Möglichkeiten, sich der Pflanzenzüchtung mit schnellem Phänotyp-Screening zu nähern.
