形態学の科学と細胞の品質、デンプン顆粒、およびカーネル内のタンパク質体は、種子の重量と品質を決定します。本研究では、LRホワイト樹脂に埋め込まれたカーネル全体の単純な集団として提示し、カーネル全体の単純なドライ吸引方法を確立する。2つの大きな理由から、組み込み媒体としてLRホワイト樹脂を選択します。
第一に、それは低粘度と強い透過性であり、種子のこの強大なセクション、特に大量および高デンプン含有量を有する穀物成熟したカーネルのために準備する上で、その良いアプリケーションにつながります。第2に、LRホワイト樹脂に埋め込まれた試料を、蛍光顕微鏡で光下でサンプルの形態を明瞭に示すために、多くの化学染料で容易に染色することができる。作製したセクションは、細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体を明確に表すために染色することができ、また、形態学的パラメータも定量的に分析することができる。
この方法にはスタディが含まれています。ここでは、プロセスを段階的に示すために、より大きなボリュームと高デンプン含有量を持つ成熟したトウモロコシカーネルをサンプルとして使用します。まず、カーネルを単純なボトルにクリップします。
約10ミリメートルの2.5%リン酸緩衝型グルタルアルデヒドを加えます。もう1つのpH 7.2を置き、それらを両方を修正するために48時間摂氏4度でそれを置きます。次に、これらのカーネルを取り出し、2〜3ミリメートルの厚さで縦または横方向にスライスします。
鋭い両面ブレードが必要です。そして、さらに48時間それらを修正します。次に、サンプルを約10ミリメートルで3回洗うので、0.1 Mリン酸緩衝液、pH 7.2を毎回30分間洗浄します。
サンプルを段階的に水和するには、まず30%エタノール水溶液の約10ミリメートルに30分間浸し、10ミリメートルに連続して浸漬し、50%70%90%を1回、100%3回浸します。サンプルをステップごとに浸透させるために、1回25%50%75%のエタノールで希釈したLRホワイト樹脂溶液を10ミリメートルずつ、摂氏4度で100%2回毎回12時間ずつ回収します。埋め込む前に、サンプル用の台座を用意する必要があります。
2ミリメートルの遠心管に250マイクロリットルの純LRホワイト樹脂を加え、摂氏6度で48時間重合します。次に、500マイクロリットルの純LR白樹脂を連続して加え、試料をペダーで遠心管に浸潤させる。解剖学的針でサンプルをまっすぐにした後、樹脂を6度のオーブンに48時間入れます。
遠心管からこれらの埋め込みカーネルを取り出し、鋭い刃を使用してサンプルの周りに余分な樹脂を切り取ります。マイクロトーンのサンプルホルダーに樹脂ブロックを置き、余分な樹脂をサンプルの表面とブレードでサンプルの周囲に切り取ります。さらに完全な部分が形成されるまでガラスナイフでサンプルの表面をさらに研磨します。
今では2ミクロンの厚さでこの素晴らしいセクションを準備する時間です。スライスする前に、小さな銅を刃の端の約2ミリメートル上に置き、セクションがカールするのを防ぎます。セクションが伸びるにつれて、それをサポートするためにセクションの下にスポークを置きます。
次に、100マイクロリットルの水を未突出スライドに加え、完全な切れ目のない部分を慎重に処理器と一緒に水に移します。50度で加熱乾燥し、しわの部分を滑らかにします。最後に、2つの重要なヒントに注意が必要です。
まず、セクションが崩れたり涙を流したりした場合、サンプルの樹脂浸潤ごとに時間を延長する。次に、セクションにナイフに平行な線がある場合は、サンプルブロックをしっかりとクランプします。セクションがナイフに垂直のいくつかの線を持っている場合は、新しいナイフを使用してください。
細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態を観察するために、蛍光増白剤28、ヨウ素溶液、およびクマシーブリリアントブルーR250でそれぞれセクションを染色することができます。他の特定の汚れについては、提案研究に基づいてそれを行います。ここでは、澱粉顆粒を染色するヨウ素溶液を例に用います。
40マイクロリットルのヨウ素溶液を加える。そして、1分間瓶の中に保管してください。そして、カバースリーブでサンプルをカバーします。
そして、その周りの過剰なエージェントソリューションを消してください。CCTVカメラを搭載した照明顕微鏡の下でサンプルを直ちに観察し、撮影します。画像の領域、長いまたは短いアクセス、および異なる領域の細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の丸みを、形態解析ソフトウェアを使用して処理し、定量的に分析することができます。
カーネルサイズのセクション全体をLRホワイト樹脂に保持するための簡単なドライ切片法を確立します。この方法は、2ミクロンのカーネル全体の横方向および縦方向のセクションを準備することができます。または例えば、油糧種子菜種の成熟した種子全体を横断的かつ縦方向に切り離すことができる。
より大きなボリュームを持つトウモロコシの成熟したカーネル全体のセクションも正常に準備することができます。また、開発中のカーネル、調理されたカーネル、および発芽したカーネルも、この方法を用いて調査することができる。カーネル全体の準備されたセクションには、以下のアプリケーションがあります。
まず、カーネル全体のセクションを使用して、種子の組織構造を観察することができます。例えば、サフラニンで染色された油糧種子菜種の全胚のセクションは、それが明確にラジカル、ハイパーカジュアル、内側および外側のカーネル全体のセクションを細胞の形態を観察し、分析するために使用することができる。例えば、油糧種子菜種の全胚の横切片は蛍光増輝体28で染色され、細胞油は特異的に染色される。
全胚の任意の領域における細胞の微小形態は高倍率で表示することができる。層状細胞の形態パラメータは、形態解析ソフトウェアを用いて定量的に解析することができ、胚の多様な領域に若干の違いを示すことができる。蛍光増輝体28で染色されたトウモロコシの全核の横切片は、細胞の形態としても発揮でき、また、細胞の形態パラメータは、子宮内精子の多様な領域において異なっている。
全体のカーネルのセクションは、澱粉顆粒のその形態を示すためにヨウ素溶液で染色することができ、例えば、横の横、ヨウ素で染色されたトウモロコシカーネルの縦断面は、デンプン顆粒のその形態をはっきりと示すことができる。多様な領域のデンプン顆粒は、子宮内精子細胞の形態、大きさ、量が大きく異なっています。したがって、デンプン顆粒の形態学的パラメータの定量分析は、それらが子宮内精子の多様な領域で有意に異なっていることを示している。
このセクションは、タンパク質体の形態を観察し、分析するために使用することができます。例えば、澱粉タンパク質は、クマシーブリリアントブルーR250を用いて青色に染色される。油糧種子菜種の胚全体におけるデンプンタンパク質の空間分布は、低倍率で観察することができ、微細構造は高倍率で明確に発揮することができる。
また、選択した領域におけるタンパク質体の数値誤差指数および形態パラメータも定量的に分析することができる。この技術は、開発および成熟した種子からカーネル全体の樹脂セクションの最初かつ簡単な準備を提供します。全カーネルの組織構造における断面の適用、そして、細胞、デンプン顆粒、および全カーネルの異なる領域におけるタンパク質体の形態を調査する。
取得した画像を定量的に分析して、細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態パラメータを示し、さらにカーネル全体の異なる領域でそれらを比較することができます。
