この研究は、国立衛生研究所(R01 DK077195からR.M.A、R01 DK104641からR.M.AおよびD.R.Bへの助成金によって支されました。血液学/腫瘍学部門、ボストン小児病院、小児科、ハーバード大学医学部、ダナ・ファーバー癌研究所のスチュアート・オーキン博士からの貴重な意見を認めます。また、カイル・コスタがマウスの術後ケアを受けた場合、メアリー・タリアエンティ博士とハビバラ・ショジャイサーディ博士(ヤン・シ研究所博士、小児科、新生児医学部、小児科、新生児医学部、ボストン小児病院、ハーバード大学医学部)の技術支援と有益な議論に対する支援を認める。

<ol>
	<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation.">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li><li>van den Brink, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+miRNA-regulated+networks,+hubs+of+signaling,+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction.">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560 (2017).</li><li>Gheinani, A. 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Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li><li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome.">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li></ol>

利益相反は宣言されていません。

ここで説明するマウス脊髄損傷モデルは、膀胱収縮と外尿道括約筋弛緩との間の協調性の喪失による機能的な膀胱出口閉塞を作成する再現性のある方法を提供する。これは、尿路上皮および平滑筋コンパートメントの拡張を特徴とする傷害の早い時期に膀胱壁の深い改造を呼び起こす。げっ歯類のSCIモデルの実装における重要なステップには、(i)損傷後10\u201214日続く脊髄ショックの期間中の手動膀胱発現への厳格な注意が含まれる。(ii) 減量を最小限に抑える栄養豊かさ;(iii)特に反射的な空虚の復帰を超えて広がる実験のために尿のスケーリングの可能性の軽減。このモデルの制限には、一過性血尿中の血栓からのマウスの尿道閉塞の可能性、および手術後の逆行性射精後の精液凝固からの雄マウスの可能性が含まれる。
ここで説明する組織解離アプローチは、実験的侮辱から生じる組織の構造変化を考慮することの重要性を示している。単一細胞分析の増加に伴い、遺伝子発現に見られる違いは、単に解離誘発摂動の結果ではなく、疾患モデルに関連する根本的な生物学的変化を真に代表することが重要です。一般に公開されている発現データを使用することで、消化バッファーの配合を変更して、生存率を最大化しながら細胞外マトリックスの効果的な消化を確保することができました。将来のアプリケーションで考慮され得る追加の修正は、放放基菌Dの添加を含む、解離プロトコル15に敏感である即時初期遺伝子の転写を停止する。
ピペット技術は、組織を解離したり、すでに懸濁状態にある細胞を移す際に重要です。剪断力による細胞への物理的損傷を軽減するには、細胞の再懸濁時に穏やかにゆっくりとピペットすることが重要です。一般的に、広孔ピペットチップを使用することをお勧めします。標準的なヒントを使用する場合、そうでなければ細胞を損傷するせん断力を避けるために、穏やかに細胞懸濁液をピペット細胞懸濁液することが特に重要です。しかし、このプロトコルでは細胞ストレーナーを使用することは避けられませんが、細胞濃度は20%以上低下し、100μL以上の体積損失を伴います。正確な細胞数を確保するために、緊張した後に細胞濃度を決定することをお勧めします。
フローサイトメトリーでは、FMOコントロールは、重複する放出ピークからの信号のブリードスルーによるバックグラウンドの尺度を提供します。それらは、非特異的抗体結合の尺度ではなく、抗体がそのチャネルに含まれるときに存在し得るバックグラウンド染色である。非特異的抗体結合を説明するには、適切なアイソタイプコントロールを含める必要があります。背景染色の場合、負のコントロールを含める必要があります。これらのコントロールを組み合わせることで、細胞集団の正確な測定が保証されます。

正常な膀胱機能の摂動は、多くの個人の生活の質の低下につながることができます。傷害または疾患が正常な膀胱機能をどのように脱線させるかをよりよく理解するためには、膀胱内の細胞の正常な生物学的状態と、それらが実験的摂動の下でどのように変化するかを調べることが重要である。しかし、現在までに、尿膀胱内に存在する特定の細胞集団、およびそれらが傷害によってどのように変化するかを完全に特徴づけられてきた。
フローサイトメトリーや単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)などの単細胞プロファイリング法は、膀胱内の特定の細胞タイプに光を当てる可能性があります。しかし、これらのアプローチが有益な組織となるには、収穫された組織の生存率、遺伝子発現、および代表的な細胞集団の割合に影響を与えない方法で消化されなければならない。酵素分解を採用するプロトコルは、無差別プロテアーゼ活性1を介して表面マーカー発現に影響を与え、それによってフローサイトメトリーによる細胞同定に影響を与える一方、解離プロセス自体は、Van den Brinkと同僚2が最近述べたように、即時初期遺伝子の誘導につながる可能性がある。著者らは、解離に影響を受けた亜集団は小さいが、即時初期遺伝子の発現レベルが高いため、バルク発現研究で強い汚染シグナルを引き起こす可能性があることを示した。さらに、解離プロトコルの影響を受けた持続時間は、いくつかの亜集団に固有であることが示された遺伝子のバルク発現レベルを検出した。したがって、解離プロトコルの影響を考慮せずに生成された単一細胞データセットは、基礎生物学とは対照的に、解離法から生じる遺伝子発現変化をもたらす可能性がある。これらの観察は、公開された単一細胞転写法データは慎重に解釈されるべきであり、結果は独立した方法によって検証されるべきであることを示唆している。
しかし、過酷で長い解離方法は、細胞2の遺伝子発現を変化させる可能性がある。細胞の効果的な分離は、存在する細胞型の正確な表現を得るために不可欠である。膀胱は複数の細胞タイプを含む複雑な器官であるため、尿路上皮細胞や間質細胞のようないくつかの集団は比較的過小表現され得るのに対し、線維芽細胞などの他の細胞タイプは細胞外マトリックス内に存在し、単離することは困難であり得る。膀胱が脊髄損傷3、4または膀胱出口閉塞5、6で観察されたような著しい改造および線維症を受けた場合、解離はさらに困難になる。
ここでは、脊髄損傷マウス膀胱における下流単細胞解析のための最適化された組織解離方法について述べている。フローサイトメトリーを用いて、4つの酵素消化プロトコルを比較し、単一細胞懸濁液を生成し、細胞生存率をサポートし、細胞集団の正しい割合を維持する能力を比較した。この分析に基づいて、我々は、細胞死、細胞凝集体、非細胞核酸および下流分析の潜在的な阻害剤を最小限に抑えることは、高品質のデータを達成するために重要であると結論付ける。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 X Magnifying Loupes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 30-F11</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75&#34; length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75&#34; length</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type III</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 6</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS005319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 &#38; Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>V13241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer Health Care LLC,</td>
			<td>NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP</td>
			<td>2.27% Injectable Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from sheep testes, Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Inc.</td>
			<td>130-110-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4&#34; length, 0.15mm tip width</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5630</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-891-7959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115509</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD3&#949; Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100309</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100409</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100709</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108715</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116209</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 2.4G2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-7216</td>
			<td>skin protectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetropolycin eye ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>NADA # 065-016. Approved by FDA.</td>
			<td>protect eyes during anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a single cell dissociation approach for molecular analysis of urinary bladder in the mouse following spinal cord injury

我々は、眼下切裂括約筋ジシナージア、機能的膀胱出口閉塞、およびそれに続く膀胱壁改修を引き出すマウスにおける脊髄損傷の実施について述べる。損傷を受けずコントロールマウスおよび脊髄損傷マウスにおける膀胱壁の細胞組成の評価を容易にするために、高い細胞生存率をサポートし、フローサイトメトリーによる離散亜集団の検出を可能にする最適化された解離プロトコルを開発した。
脊髄損傷は、胸部脊髄の完全な切除によって生じられます。組織収穫時に、動物は深い麻酔下でリン酸緩衝生理食塩基を透過させ、膀胱はタイロードの緩衝液に収穫される。組織は、一般に入手可能な遺伝子発現データベースの尋問によって決定されるマウス膀胱のコラーゲン含有量に基づいて最適化された消化バッファーのインキュベーションに先立って細かく刻まれる。単一細胞懸濁液の生成後、細胞生存率、細胞数および特定の亜集団の評価のために、物質をフローサイトメトリーによって分析する。我々は、この方法が90%以上の生存率を有する細胞集団を生み出し、間葉系および上皮起源の細胞を強く表していることを実証する。この方法は、マウス膀胱および潜在的に他の器官における離散細胞タイプの正確な下流分析を可能にする。

手術 胸部脊髄切除の成功は、多くのパラメータの評価によって決定され、その中で最も明白なのは後肢麻痺である。動物は前肢のみを使用して動き、後肢をドラッグします。それ以外の場合は、摂食、グルーミング、覚醒を含む活動レベルは通常正常です。さらに、動物は、損傷後10〜14日で反射空隙が戻るまで、12時間ごとに研究者による手動膀胱発現の必要性をもたらす意志膀胱制御を失う。安楽死後、傷害の成功の追加徴候は、主に膀胱と体重の増加に関連し、組織のリモデリングを示す。組織学的分析は、尿路上皮および平滑筋区画3の両方の内の過形成を明らかにする。
単細胞懸濁液の調製 一般に公開された発現データを用いて、細胞外マトリックスタンパク質に対する膀胱組織の濃縮を決定し(図2)、消化ミックスの処方を知らせるために使用した。コラーゲンは膀胱壁11,12の主要成分であるため、まずMouse ENCODEプロジェクト13によって生成されたRNAプロファイリングデータセットを用いて、マウス膀胱内で最も豊富なコラーゲンを特定することを求めた。我々の分析は、コラーゲン1A1、コラーゲン3A1、コラーゲン1A2およびコラーゲン6A1がマウス膀胱内で最も豊富なコラーゲン型であることを示した(図2A)。また、Tabula Muris(マウス(Musmusculus)からの単一細胞転写体データのコンペンディウム)8を使用して、コラーゲン1、3、6およびヒアルロナンのmRNA発現レベルを決定しました。このデータにより、組織間で共有される細胞タイプの遺伝子発現を直接および制御した比較が可能になります。この分析により、これらの細胞外マトリックス成分の発現は、ウロテリウムではなく間葉系細胞タイプにおいてより一般的であることを明らかにした(図2B)。
膀胱からの単離細胞の生存可能性に及ぼす解離の影響 フローサイトメトリー分析は、4つの異なるプロトコルを用いた酵素消化が、それぞれ83%、86%、93%または90%の生存率をもたらすことを実証した。したがって、プロトコルセクション3は、細胞生存率の保存にとって最も価値があると考えられた。また、細胞の約4%が壊死的であることを観察した(PI+/Annexin V-) (図4A)。これらの観察は、消化プロトコルの効率と細胞生存率に関するその後の利益を強調する。
膀胱内の細胞の異なる集団に及ぼす脊髄損傷の影響 我々は、対照と比較してSCIマウスの膀胱における総細胞数の有意な増加を観察した。SCI膀胱から得られたドットプロットのパターンも、脊髄損傷による進行中の臓器改修と若干異なっていた(図4B:第1列)。対照と比較して、SCI動物からの膀胱はCD45陽性細胞の有意な増加を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> 図1:肝臓の明るい色での代表的な灌流完了。(A) 灌流の開始時に肝臓の色を示す。(B)は、灌流終了時の明るい肝臓色を示す。(A)中のマウスは、膀胱肥大を生じ、脊髄損傷を有していない(B)のマウスとは異なり、骨盤から突出した膀胱肥大および突出を生じる2週間前に脊髄切除を有していた。この場合、膀胱は小さく、骨盤に隠されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> 図2:マウス膀胱における細胞外マトリックス(ECM)成分の転写発現。(A)43種類のコラーゲンタイプの棒グラフ。この式は、100 万回のマッピング済み読み取り (RPKM) あたりのトランスクリプトのキロベースあたりの読み取りによって記述されます (データは BioProject から収集されます: PRJNA66167)14.(B) 男性と女性の解離尿膀胱サンプル(男性と女性)のプールでマイクロ流体液滴ベースの3'末端カウントから得られた細胞タイプにおける遺伝子発現のバイオリンプロット。カウントは、100万ln(CPM+1)8あたり1+カウントの自然対数を使用して、各セルに対して対数正規化された。対数を取る前に、1 CPM の疑似カウントが追加されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> 図3:Gating戦略及びFMO制御により、蛍光の広がりを判定する。(A) 細胞集団の選択(B) シングルトのガッティング戦略。(C)壊死細胞のガッティング、PIおよびアネキシンV抗体を用いた早期および後期のアポトーシス細胞。(D\u2012F)多色流細胞測定の模式ドットプロット(例えば、A、B、C、Dフルオロクロム+(アネキシンVおよびPI)と共役する抗体)。これは、FMO制御によって示された蛍光膜Aチャネルを用いて、染色されていない対照と比較して、抗体に広がった蛍光を示す。オレンジ色の点線は、赤で染色されていない境界と比較してFMO格数境界を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> 図4:膀胱内の異なる細胞タイプのフローサイトメトリー。(A) アネキシン V/PI 二重染色フローチャート.各プロトコルに使用される酵素と化学の異なる組み合わせは、対応する生存率プロットの前に表されます。これらのデータは、プロトコルセクション3で最も高い生存率を示す。(B)単一チャネルで検出されたLy-6A/E(Sca-1)およびCD326(Ep-CAM)の強度を示す代表的なヒストグラム。(C) マウス膀胱の細胞集団に対するSCIの影響上パネルは、コントロール非外科的マウスおよび下パネルから得られた3つの解離された膀胱の染色の結果を示し、SCIを有する3つの動物に染色した結果を示す。最初の列は、セルの総母集団です。2 番目の列は、単一の格紙の選択を示しています。3番目の列は、B細胞、T細胞およびNK細胞に対して負の生細胞のサブ集団を示している。4番目の列は、CD45に陽性の生細胞の染色を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>金額(500mL)</td>
			<td>モルリティ</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0.186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0.0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-グルコース</td>
			<td>0.9 g</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
			<td>1.19 g</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:タイロードの溶液の準備のためのコンポーネント。 示されたコンポーネントは、500 mLタイローデの溶液の調製用です。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>量</td>
			<td>プロトコルセクション 1</td>
			<td>プロトコルセクション 2</td>
			<td>プロトコルセクション 3</td>
			<td>プロトコルセクション 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0.03 mM</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼタイプI型</td>
			<td>132.5単位</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼ III型</td>
			<td>96.4単位</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>コラゲナーゼ型VI型</td>
			<td>50単位</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase</td>
			<td>10台</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>パパイン</td>
			<td>115台</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>パン コラゲナーゼ</td>
			<td>50単位</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヒアルロニダーゼ</td>
			<td>10.5単位</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
<tr>
<td>ディスパーゼII</td>
			<td>1.25単位</td>
			<td>はい</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>細胞解離解</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>組換え酵素</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
			<td>-</td>
			<td>はい</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:消化バッファーの調製のためのコンポーネント。 示された成分は、2.5 mLの消化混合(1 Uは37°Cで1分間に1μmol基質の加水分解を触媒する)の調製用である。 各酵素の単位の定義については、製品データシートを参照)。

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A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

このプロトコルの目的は、脊髄損傷のマウスモデルに最適化された組織解離プロトコルを適用し、フローサイトメトリーによる単一細胞分析のアプローチを検証することです。

脊髄損傷後のマウスにおける膀胱の分子解析のための単一細胞解離アプローチ

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

5.4K ビュー.  Boston Children's Hospital. このプロトコルの目的は、脊髄損傷のマウスモデルに最適化された組織解離プロトコルを適用し、フローサイトメトリーによる単一細胞分析のアプローチを検証することです。

ビデオ: A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

生物学

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapperと超解像顕微鏡のためのオープンソースの単一粒子分析

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

注入カテーテル電極の繰り返し測定を可能にすると目がさめているラットの膀胱内圧測定と外部尿道括約筋の測定

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

電気穿孔法によるマウス膀胱尿路上皮にプラスミド DNA 配信法

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis beneath the injury site. To date, there is no functional recovery therapy for SCI, and there is a lack of clarity regarding the many complexes and dynamic events occurring after SCI. Many non-mammalian organisms can regenerate after severe SCI, such as teleost fishes, urodele amphibians, and larval stages of anuran amphibians, including Xenopus laevis tadpoles. These are bona fide model organisms to study and understand the response to SCI and the mechanisms underlying successful regenerative processes. This type of research can lead to the identification of potential targets for SCI therapeutic intervention. This article describes how to perform Xenopus laevis tadpole spinal cord transection, including husbandry, surgery, postsurgery care, and functional test evaluation. This injury method can be applied for elucidating the different steps of spinal cord regeneration by studying the cellular, molecular, and genetic mechanisms, as well as histological and functional evolution after SCI and during spinal cord regeneration.

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole spinal cord transection is a relevant injury method to study spinal cord injury and regeneration by making a transverse cut that completely severs the spinal cord at the thoracic level.

アフリカツメガエル・ ラエビス ・オタマジャクシの脊髄切除

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

マイクロタンパク質同定と配列解析のための統合アプローチ

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...