Este trabalho foi apoiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 DK077195 a R.M.A, R01 DK104641 a R.M.A e D.R.B). Reconhecemos informações valiosas do Dr. Stuart Orkin na Divisão de Hematologia/Oncologia, Hospital Infantil de Boston, Departamento de Pediatria, Harvard Medical School e no Instituto de Câncer Dana-Farber. Também reconhecemos o apoio de Kyle Costa no cuidado pós-operatório de camundongos, Mary Taglienti e Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Departamento de Pediatria, Divisão de Medicina Recém-Nascida, Departamento de Pediatria, Divisão de Medicina Recém-Nascida, Hospital Infantil de Boston, Harvard Medical School) para assistência técnica e discussões úteis.

<ol>
	<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation.">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li><li>van den Brink, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+miRNA-regulated+networks,+hubs+of+signaling,+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction.">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560 (2017).</li><li>Gheinani, A. 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(78), e50111 (2013).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. 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Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li><li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome.">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li></ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

O modelo de lesão medular do camundongo descrito aqui fornece um método reprodutível para criar uma obstrução funcional da saída da bexiga devido à perda de coordenação entre a contração da bexiga e o relaxamento do esfíncter uretral externo. Isso, por sua vez, evoca uma profunda remodelação da parede da bexiga logo após 2 semanas após a lesão caracterizada pela expansão dos compartimentos musculares urotelial e liso. As etapas críticas na implementação do modelo SCI em roedores incluem (i) atenção rigorosa à expressão manual da bexiga durante o período de choque espinhal que se segue para 10\u201214 dias após a lesão; (ii) enriquecimento nutricional para minimizar a perda de peso; e (iii) mitigação do potencial de escaldação de urina particularmente para experimentos que vão além do retorno do vazio reflexo. As limitações do modelo incluem o potencial de oclusão uretral em camundongos a partir de coágulos sanguíneos durante o período de hematuria transitória, e adicionalmente em camundongos machos de coagulo de semen após ejaculação retrógrada após a cirurgia.
A abordagem de dissociação tecidual descrita aqui ilustra a importância de considerar mudanças estruturais nos tecidos decorrentes do insulto experimental, neste caso uma remodelação significativa do tecido após a SCI que pode influenciar as análises a jusante. Com o aumento das análises de células únicas, é fundamental garantir que as diferenças observadas na expressão genética não sejam simplesmente resultado de perturbações induzidas por dissociação, mas sejam verdadeiramente representativas das mudanças biológicas subjacentes relevantes para o modelo da doença. O uso de dados de expressão disponíveis publicamente nos permitiu modificar a formulação de buffers de digestão para garantir uma digestão eficaz da matriz extracelular, maximizando a viabilidade. Modificações adicionais que poderiam ser consideradas em aplicações futuras incluem a adição de actinomicina D, para interromper a transcrição de genes iniciais imediatos sensíveis ao protocolo de dissociação15.
A técnica de pipetação é crucial ao dissociar tecido ou transferir células que já estão em suspensão. Para reduzir os danos físicos às células das forças de tesoura, é importante pipeta suavemente e lentamente durante a ressuspensão celular. É geralmente recomendado usar pontas de pipeta largas. Se usar as pontas padrão, é particularmente importante que as suspensões de células pipetas suavemente evitem forças de tesoura que de outra forma danificariam as células. O uso de filtros celulares é inevitável neste protocolo, no entanto, a concentração celular pode diminuir em 20% ou mais, acompanhada de uma perda de volume de 100 μL ou mais. Recomendamos que a concentração celular seja determinada após o esforço para garantir uma contagem precisa de células.
Na citometria de fluxo, os controles de FMO fornecem uma medida de fundo devido à sangria do sinal de picos de emissões sobrepostos. Eles não são uma medida de ligação de anticorpos inespecíficos, ou coloração de fundo que pode estar presente quando um anticorpo é incluído nesse canal. Para explicar a vinculação de anticorpos nãopecíficos, é preciso incluir controles isótipos apropriados; para a coloração de fundo, é preciso incluir controles negativos. Juntos, esses controles garantem uma medição precisa das populações celulares.

Perturbações da função normal da bexiga urinária podem levar à diminuição da qualidade de vida de muitos indivíduos. Para obter uma melhor compreensão de como lesões ou doenças descarrilam a função normal da bexiga, é importante sondar o estado biológico normal das células dentro da bexiga e como elas mudam sob perturbação experimental. Até hoje, porém, as populações celulares específicas que residem dentro da bexiga urinária, e como mudam com lesões, têm sido incompletamente caracterizadas.
Métodos de criação de perfil de células únicas, como citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) têm o potencial de lançar luz sobre tipos de células específicas dentro da bexiga. No entanto, para que essas abordagens sejam um tecido informativo deve ser digerido de forma que não afete a viabilidade, a expressão genética e os percentuais representativos da população celular do tecido colhido. Protocolos que empregam desagregação enzimática podem impactar a expressão do marcador de superfície através da atividade de protease indiscriminada1, impactando assim a identificação celular por citometria de fluxo, enquanto o processo de dissociação em si pode levar à indução de genes precoces imediatos, como descrito recentemente por Van den Brink e colegas2. Os autores mostraram que, embora a subpopulação afetada pela dissociação fosse pequena, poderia desencadear um forte sinal contaminante em estudos de expressão em massa devido aos altos níveis de expressão de genes precoces imediatos. Além disso, a duração do protocolo de dissociação afetou os níveis de expressão em massa detectados de genes mostrados exclusivos de algumas subpopulações. Assim, conjuntos de dados unicelulares gerados sem contabilizar o impacto do protocolo de dissociação podem produzir alterações na expressão genética decorrentes do método de dissociação, em oposição à biologia subjacente. Essas observações sugerem que os dados de transcrição de células únicas publicados devem ser interpretados com cautela, e que os resultados devem ser validados por métodos independentes.
Embora, métodos de dissociação severos e demorados possam alterar a expressão genética nas células2; o isolamento efetivo das células é essencial para obter uma representação precisa dos tipos celulares presentes. Uma vez que a bexiga é um órgão complexo composto por vários tipos de células, algumas populações como células urteliais ou estromais podem ser relativamente sub-representadas, enquanto outros tipos de células, como os fibroblastos, existem dentro da matriz extracelular e podem ser desafiadoras para se isolar. A dissociação torna-se ainda mais desafiadora se a bexiga tiver sofrido remodelação significativa e fibrose, como a observada na lesão medular3,4 ou obstrução da saída da bexiga5,6.
Aqui, descrevemos um método otimizado de dissociação de tecido para análise de células únicas a jusante na bexiga do rato lesado pela medula espinhal. Usando citometria de fluxo, comparamos quatro protocolos de digestão enzimática por sua capacidade de produzir uma única suspensão celular, suportar a viabilidade celular e manter a proporção correta das populações celulares. Com base nesta análise, concluímos que minimizar a morte celular, os agregados celulares, os ácidos nucleicos não celulares e os potenciais inibidores da análise a jusante são fundamentais para alcançar dados de alta qualidade.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 X Magnifying Loupes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 30-F11</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75&#34; length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75&#34; length</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type III</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 6</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS005319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 &#38; Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>V13241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer Health Care LLC,</td>
			<td>NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP</td>
			<td>2.27% Injectable Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from sheep testes, Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Inc.</td>
			<td>130-110-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4&#34; length, 0.15mm tip width</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5630</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-891-7959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115509</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD3&#949; Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100309</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100409</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100709</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108715</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116209</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 2.4G2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-7216</td>
			<td>skin protectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetropolycin eye ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>NADA # 065-016. Approved by FDA.</td>
			<td>protect eyes during anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a single cell dissociation approach for molecular analysis of urinary bladder in the mouse following spinal cord injury

Descrevemos a implementação de lesão medular em camundongos para provocar dissynergia detrusor-esfíncter, uma obstrução funcional da saída da bexiga e posterior remodelação da parede da bexiga. Para facilitar a avaliação da composição celular da parede da bexiga no controle não ferido e camundongos lesados na medula espinhal, desenvolvemos um protocolo de dissociação otimizado que suporta alta viabilidade celular e permite a detecção de subpopulações discretas por citometria de fluxo.
A lesão medular é criada por transeção completa da medula espinhal torácica. No momento da colheita de tecidos, o animal é perfundido com soro fisiológico tamponado com fosfato sob anestesia profunda e bexigas são colhidas no tampão de Tyrode. Os tecidos são picados antes da incubação no tampão de digestão que foi otimizado com base no conteúdo de colágeno da bexiga do rato, conforme determinado pelo interrogatório de bancos de dados de expressão genética disponíveis publicamente. Após a geração de uma única suspensão celular, o material é analisado por citometria de fluxo para avaliação da viabilidade celular, número celular e subpopulações específicas. Demonstramos que o método produz populações celulares com maior viabilidade de 90%, e representação robusta de células de origem mesenquimal e epitelial. Este método permitirá uma análise precisa a jusante de tipos de células discretas na bexiga do rato e, potencialmente, em outros órgãos.

Procedimento cirúrgico O sucesso da transeção da medula espinhal torácica é determinado pela avaliação de uma série de parâmetros, sendo o mais óbvio a paralisia da medula espinhal. O animal se move apenas usando seus membros dianteiros, arrastando seus traseiros. Caso contrário, os níveis de atividade, incluindo alimentação, preparação e alerta são tipicamente normais. Além disso, os animais perdem o controle volicional da bexiga, resultando na necessidade de expressão manual da bexiga pelo investigador a cada 12 h até que o reflexo anulado retorne em 10 a 14 dias após a lesão. Após a eutanásia, sinais adicionais do sucesso da lesão referem-se principalmente ao aumento da relação peso bexiga-corpo, indicativo de remodelação tecidual. A análise histológica revela a hiperplasia dentro dos compartimentos musculares urotelial e liso3.
Preparação de suspensão de célula única Utilizando dados de expressão disponíveis publicamente, foi determinado o enriquecimento do tecido da bexiga para proteínas matricias extracelulares(Figura 2) e utilizado para informar a formulação da mistura de digestão. Como as collagens são componentes-chave da parede da bexiga11,12, primeiro procuramos determinar o colágeno mais abundante na bexiga do mouse usando conjuntos de dados de perfil de RNA gerados pelo projeto Mouse ENCODE13. Nossa análise mostrou que o colágeno 1A1, o colágeno 3A1, o colágeno 1A2 e o colágeno 6A1 são os tipos mais abundantes de colágeno dentro da bexiga do rato(Figura 2A). Também usamos o Tabula Muris (um compêndio de dados de transcriptome de célula única do mouse (Mus musculus))8 para determinar o nível de expressão mRNA de collagens 1, 3, 6 e hialuuronan. Os dados permitem a comparação direta e controlada da expressão genética em tipos celulares compartilhados entre tecidos. Esta análise revelou que a expressão desses componentes da matriz extracelular é mais prevalente nos tipos de células mesenquimais do que no urotélio(Figura 2B).
Efeito da dissociação na viabilidade de células isoladas da bexiga A análise da citometria de fluxo demonstrou que a digestão enzimática utilizando os 4 protocolos diferentes produziu viabilidade de 83%, 86%, 93% ou 90%, respectivamente. Assim, o protocolo seção 3 foi considerado mais valioso para a preservação da viabilidade celular. Observou-se também que aproximadamente 4% das células eram necroséticas (PI+/AnnexinV-) ( Figura4A). Essas observações enfatizam a eficiência do protocolo de digestão e o benefício subsequente na viabilidade celular.
Efeito da lesão medular em diferentes populações de células na bexiga Observamos um aumento significativo no número total de células nas bexigas de camundongos SCI em comparação com os controles. O padrão das parcelas de pontos obtidas das bexigas SCI também foi ligeiramente diferente consistente com a remodelação contínua do órgão devido à lesão medular(Figura 4B: primeira coluna). Em comparação com os controles, as bexigas dos animais SCI apresentaram um aumento significativo nas células CD45 positivas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Figura 1: Conclusão representativa da perfusão com cor iluminada do fígado. (A) Demonstra a cor do fígado no início da perfusão. (B) Mostra a cor do fígado clareado no final da perfusão. O camundongo em (A) fez transeção da medula espinhal duas semanas antes da perfusão resultando em hipertrofia da bexiga e sua saliência fora da pelve ao contrário do camundongo em (B) que não tinha lesão medular; neste caso, a bexiga é pequena e escondida na pélvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Figura 2: Expressão transcriômica de componentes de matriz extracelular (ECM) na bexiga do rato. (A) Gráfico de barras de 43 tipos diferentes de colágeno. A expressão é indicada por Reads Per Kilobase de transcrição, por milhão de leituras mapeadas (RPKM) (os dados são coletados do BioProject: PRJNA66167)14. (B) Parcelas de violino de expressão genética em tipos celulares obtidas a partir da contagem microfluídica de gotículas 3'-end em um pool de amostras de bexiga urinária dissociada masculina e feminina (macho e fêmea). As contagens foram normalizadas para cada célula usando o logaritmo natural de mais de 1 milhão de ln (CPM+1)8. Uma pseudoconta de 1 CPM foi adicionada antes de tomar logaritmos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Figura 3: Estratégia de gating e controles FMO para determinar a propagação da fluorescência. (A)Seleção da população celular. (B) Estratégia de gating para singlets. (C) Gating para células apoptóticas necróticas e precoces e tardias usando anticorpo pi e anexo V. (D\u2012F) Um gráfico de ponto esquemático de citometria de fluxo multicolor (por exemplo, anticorpos conjugados com A, B, C, D fluorochromes + (Anexo V e PI). Isso mostra a fluorescência espalhada no anticorpo com fluorocromo um canal mostrado pelo controle FMO em comparação com um controle não manchado. A linha pontilhada laranja representa o limite de ogmização do FMO em comparação com o limite não localizado em vermelho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Figura 4: Citometria de fluxo de diferentes tipos de células na bexiga. (A) Anexo V/PI gráficos de fluxo de coloração dupla. As diferentes combinações de enzimas e produtos químicos utilizados para cada protocolo são representadas em frente ao enredo de viabilidade correspondente. Esses dados demonstram que a maior viabilidade foi obtida com a seção de protocolo 3. (B) Histogramas representativos ilustrando a intensidade de Ly-6A/E (Sca-1) e CD326 (Ep-CAM) detectados em canais únicos. (C) Efeito de SCI na população celular da bexiga do rato. O painel superior mostra resultados de coloração em três bexigas dissociadas obtidas a partir do controle de camundongos não cirúrgicos e painel inferior mostra os resultados da coloração em três animais com SCI. A primeira coluna é a população celular total. A segunda coluna mostra a seleção de gating singlet. A terceira coluna mostra a subpopulação de células vivas que são negativas para células B, células T e células NK. A quarta coluna mostra a coloração de células vivas positivas para CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Quantidade (para 500 mL)</td>
			<td>Molarity</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glicose</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Componentes para a preparação da solução de Tyrode. Os componentes indicados são para a preparação da solução de 500 mL Tyrode.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Quantidade</td>
			<td>Protocolo seção 1</td>
			<td>Protocolo seção 2</td>
			<td>Seção de protocolo 3</td>
			<td>Seção de protocolo 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mgs</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase Tipo I</td>
			<td>132,5 unidades</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase Tipo III</td>
			<td>96,4 unidades</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenase Tipo VI</td>
			<td>50 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase</td>
			<td>10 unidades</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papaína</td>
			<td>115 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Collagenase</td>
			<td>50 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hialuronidase</td>
			<td>10,5 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1,25 unidades</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solução de dissociação celular</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzima recombinante</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
			<td>-</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Componentes para a preparação do tampão de digestão. Os componentes indicados são para a preparação de 2,5 mL de mistura de digestão (1 U catalisa a hidrólise de 1 μmol um substrato por minuto a 37 °C. Consulte a folha de dados do produto para definição de unidade de cada enzima).

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A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

O objetivo deste protocolo é aplicar um protocolo otimizado de dissociação tecidual a um modelo de camundongo de lesão medular e validar a abordagem para análise de célula única por citometria de fluxo.

Uma única abordagem de dissociação celular para análise molecular da bexiga urinária no rato após lesão medular

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

5.4K visualizações.  Boston Children's Hospital. O objetivo deste protocolo é aplicar um protocolo otimizado de dissociação tecidual a um modelo de camundongo de lesão medular e validar a abordagem para análise de célula única por citometria de fluxo.

Vídeo: A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biologia

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Medições de esfíncter uretral Cystometric e externo em ratos acordados com cateter implantado e eletrodos permitindo medições repetidas

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Novo método de entrega de DNA do plasmídeo para Mouse bexiga Urotélio por eletroporação

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis beneath the injury site. To date, there is no functional recovery therapy for SCI, and there is a lack of clarity regarding the many complexes and dynamic events occurring after SCI. Many non-mammalian organisms can regenerate after severe SCI, such as teleost fishes, urodele amphibians, and larval stages of anuran amphibians, including Xenopus laevis tadpoles. These are bona fide model organisms to study and understand the response to SCI and the mechanisms underlying successful regenerative processes. This type of research can lead to the identification of potential targets for SCI therapeutic intervention. This article describes how to perform Xenopus laevis tadpole spinal cord transection, including husbandry, surgery, postsurgery care, and functional test evaluation. This injury method can be applied for elucidating the different steps of spinal cord regeneration by studying the cellular, molecular, and genetic mechanisms, as well as histological and functional evolution after SCI and during spinal cord regeneration.

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole spinal cord transection is a relevant injury method to study spinal cord injury and regeneration by making a transverse cut that completely severs the spinal cord at the thoracic level.

Transeção da Medula Espinhal em Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

Uma abordagem integrada para identificação de microproteínas e análise de sequências

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...