Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R01 DK077195 a R.M.A, R01 DK104641 a R.M.A y D.R.B). Reconocemos valiosas aportaciones del Dr. Stuart Orkin en la División de Hematología/Oncología, el Hospital infantil de Boston, el Departamento de Pediatría, la Escuela de Medicina de Harvard y el Dana-Farber Cancer Institute. También reconocemos el apoyo de Kyle Costa en la atención postoperatoria de ratones, Mary Taglienti y el Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Laboratorio Dr. Yang Shi, Departamento de Pediatría, División de Medicina del Recién Nacido, Departamento de Pediatría, División de Medicina del Recién Nacido, Hospital infantil de Boston, Escuela de Medicina de Harvard) para asistencia técnica y discusiones útiles.

<ol>
	<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation.">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li><li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility.">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24 (2013).</li><li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway.">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+miRNA-regulated+networks,+hubs+of+signaling,+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction.">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction.">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li><li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats.">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111 (2013).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases.">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li><li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice.">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I:+architecture,+development+and+disease.">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II:+regenerative+applications.">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li><li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome.">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li></ol>

No se declararon conflictos de intereses.

El modelo de lesión de la médula espinal del ratón descrito aquí proporciona un método reproducible para crear una obstrucción funcional de la salida de la vejiga debido a la pérdida de coordinación entre la contracción de la vejiga y la relajación del esfínter uretral externo. Esto a su vez evoca una profunda remodelación de la pared de la vejiga tan pronto como 2 semanas después de la lesión caracterizada por la expansión de los compartimentos musculares uroteliales y lisos. Los pasos críticos en la implementación del modelo SCI en roedores incluyen (i) una atención rigurosa a la expresión manual de la vejiga durante el período de choque espinal que se produce durante 10\u201214 días después de la lesión; (ii) enriquecimiento nutricional para minimizar la pérdida de peso; y (iii) mitigación del potencial de escaldado de orina, particularmente para experimentos que se extienden más allá del retorno de la anulación de reflejos. Las limitaciones del modelo incluyen el potencial de oclusión uretral en ratones a partir de coágulos sanguíneos durante el período de hematuria transitoria, y adicionalmente en ratones machos de coagulum de semen después de la eyaculación retrógrada después de la cirugía.
El enfoque de disociación de tejidos descrito aquí ilustra la importancia de considerar los cambios estructurales en los tejidos que surgen del insulto experimental, en este caso la remodelación significativa de tejidos después de SCI que puede influir en los análisis posteriores. Con el aumento de los análisis unicelulares es fundamental garantizar que las diferencias observadas en la expresión génica no sean simplemente el resultado de perturbaciones inducidas por la disociación, sino que sean verdaderamente representativas de los cambios biológicos subyacentes relevantes para el modelo de enfermedad. El uso de datos de expresión disponibles públicamente nos permitió modificar la formulación de búferes de digestión para garantizar una digestión eficaz de la matriz extracelular al tiempo que maximizamos la viabilidad. Las modificaciones adicionales que podrían considerarse en futuras aplicaciones incluyen la adición de actinomicina D, para detener la transcripción de genes tempranos inmediatos que son sensibles al protocolo de disociación15.
La técnica de pipeteo es crucial a la hora de disociar tejido o transferir células que ya están en suspensión. Para reducir el daño físico a las células de las fuerzas de cizallamiento, es importante pipetear suavemente y lentamente durante la resuspensión celular. Por lo general, se recomienda utilizar puntas de pipeta de diámetro ancho. Si se utilizan puntas estándar, es particularmente importante pipetear las suspensiones celulares suavemente para evitar fuerzas de cizallaje que de otro modo dañarían las células. El uso de coladores celulares es inevitable en este protocolo, sin embargo, la concentración celular puede disminuir en un 20% o más, acompañada de una pérdida de volumen de 100 μL o más. Recomendamos que se determine la concentración celular después del esfuerzo para garantizar un recuento preciso de células.
En la citometría de flujo, los controles FMO proporcionan una medida de fondo debido al sangrado de la señal de los picos de emisión superpuestos. No son una medida de unión de anticuerpos inespecífico, o tinción de fondo que puede estar presente cuando un anticuerpo se incluye en ese canal. Para tener en cuenta el enlace de anticuerpos no específicos, hay que incluir controles de isotipo adecuados; para la tinción de fondo, uno necesita incluir controles negativos. En conjunto, estos controles garantizan una medición precisa de las poblaciones celulares.

Perturbaciones de la función normal de la vejiga urinaria pueden conducir a una disminución de la calidad de vida para muchas personas. Con el fin de obtener una mejor comprensión de cómo la lesión o enfermedad descarrila la función normal de la vejiga, es importante sondear el estado biológico normal de las células dentro de la vejiga y cómo cambian bajo perturbación experimental. Hasta la fecha, sin embargo, las poblaciones celulares específicas que residen dentro de la vejiga urinaria, y cómo cambian con lesiones, se han caracterizado incompletamente.
Los métodos de generación de perfiles de células únicas, como la citometría de flujo o la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq), tienen el potencial de arrojar luz sobre tipos de células específicos dentro de la vejiga. Sin embargo, para que estos enfoques sean tejidos informativos deben digerirse de una manera que no afecte la viabilidad, la expresión génica y los porcentajes representativos de población celular del tejido cosechado. Los protocolos que emplean la desagregación enzimática pueden afectar la expresión de marcadores superficiales a través de la actividad de proteasa indiscriminada1,afectando así a la identificación celular por citometría de flujo, mientras que el propio proceso de disociación puede conducir a la inducción de genes tempranos inmediatos, como describieron recientemente Van den Brink y sus colegas2. Los autores mostraron que aunque la subpoblación afectada por la disociación era pequeña, podría desencadenar una fuerte señal contaminante en estudios de expresión a granel debido a los altos niveles de expresión de los genes tempranos inmediatos. Además, la duración del protocolo de disociación afectado detectó niveles de expresión masiva de genes que se demostró que son únicos para algunas subpoblaciones. Por lo tanto, los conjuntos de datos unicelulares generados sin tener en cuenta el impacto del protocolo de disociación pueden producir cambios en la expresión génica derivados del método de disociación, en lugar de la biología subyacente. Estas observaciones sugieren que los datos de transcriptómica de una sola célula publicados deben interpretarse con precaución, y que los resultados deben ser validados por métodos independientes.
Aunque, los métodos de disociación duros y largos pueden alterar la expresión génica en las células2; el aislamiento efectivo de las células es esencial para obtener una representación precisa de los tipos de células presentes. Dado que la vejiga es un órgano complejo que comprende múltiples tipos de células, algunas poblaciones como las células uroteliales o estromales pueden estar relativamente infrarrepresentadas, mientras que otros tipos celulares como los fibroblastos existen dentro de la matriz extracelular y pueden ser difíciles de aislar. La disociación se vuelve aún más difícil si la vejiga ha sido sometida a una remodelación significativa y fibrosis como la observada en la lesión de la médula espinal3,4 u obstrucción de salida de la vejiga5,6.
Aquí, describimos un método de disociación de tejido optimizado para el análisis de células individuales aguas abajo en la vejiga del ratón lesionada de la médula espinal. Usando citometría de flujo, comparamos cuatro protocolos de digestión enzimática por su capacidad para producir una sola suspensión celular, apoyar la viabilidad celular y mantener la proporción correcta de poblaciones celulares. Sobre la base de este análisis, llegamos a la conclusión de que minimizar la muerte celular, agregados celulares, ácidos nucleicos no celulares e inhibidores potenciales del análisis posterior son críticos para lograr datos de alta calidad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 X Magnifying Loupes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 30-F11</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75&#34; length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75&#34; length</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type III</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 6</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS005319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 &#38; Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>V13241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer Health Care LLC,</td>
			<td>NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP</td>
			<td>2.27% Injectable Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from sheep testes, Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Inc.</td>
			<td>130-110-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4&#34; length, 0.15mm tip width</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5630</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-891-7959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115509</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD3&#949; Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100309</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100409</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100709</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108715</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116209</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 2.4G2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-7216</td>
			<td>skin protectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetropolycin eye ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>NADA # 065-016. Approved by FDA.</td>
			<td>protect eyes during anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a single cell dissociation approach for molecular analysis of urinary bladder in the mouse following spinal cord injury

Describimos la implementación de lesiones de la médula espinal en ratones para provocar disynergia de detrusor-esfínter, una obstrucción funcional de la salida de la vejiga y una posterior remodelación de la pared de la vejiga. Para facilitar la evaluación de la composición celular de la pared de la vejiga en ratones lesionados y de control no lesionados, desarrollamos un protocolo de disociación optimizado que apoya la alta viabilidad celular y permite la detección de subpoblación discreta por citometría de flujo.
La lesión de la médula espinal se crea mediante la transección completa de la médula espinal torácica. En el momento de la cosecha de tejidos, el animal se perfunde con solución salina tamponada por fosfato bajo anestesia profunda y las vejigas se cosechan en el tampón de Tyrode. Los tejidos se pican antes de la incubación en un búfer de digestión que se ha optimizado en función del contenido de colágeno de la vejiga del ratón, según lo determinado por el interrogatorio de bases de datos de expresión génica disponibles públicamente. Después de la generación de una sola suspensión celular, el material es analizado por la citometría de flujo para la evaluación de la viabilidad celular, el número de célula y las subpoblaciones específicas. Demostramos que el método produce poblaciones celulares con mayor viabilidad del 90%, y una sólida representación de células de origen mesenquimal y epitelial. Este método permitirá un análisis preciso aguas abajo de los tipos de células discretas en la vejiga del ratón y potencialmente otros órganos.

Procedimiento quirúrgico El éxito de la transección torácica de la médula espinal está determinado por la evaluación de una serie de parámetros, el más obvio de los cuales es la parálisis del hindlimb. El animal se mueve sólo usando sus extremidades delanteras, arrastrando sus extremidades posteriores. De lo contrario, los niveles de actividad, incluyendo alimentación, aseo y estado de alerta suelen ser normales. Además, los animales pierden el control volicional de la vejiga, lo que resulta en la necesidad de expresión manual de la vejiga por parte del investigador cada 12 h hasta que el anulamiento reflejo vuelve a los 10 a 14 días después de la lesión. Después de la eutanasia, los signos adicionales del éxito de la lesión se relacionan principalmente con el aumento en la relación vejiga-cuerpo de peso, indicativo de la remodelación de tejidos. El análisis histológico revela hiperplasia dentro de los compartimentos musculares uroteliales y lisos3.
Preparación de la suspensión de una sola célula Utilizando datos de expresión disponibles públicamente, se determinó el enriquecimiento del tejido vesical para proteínas de matriz extracelular(Figura 2)y se utilizó para informar la formulación de la mezcla de digestión. Dado que los colágenos son componentes clave de la pared de la vejiga11,12,primero buscamos determinar los colágenos más abundantes en la vejiga del ratón utilizando conjuntos de datos de perfilado de ARN generados por el proyecto Mouse ENCODE13. Nuestro análisis mostró que el colágeno 1A1, el colágeno 3A1, el colágeno 1A2 y el colágeno 6A1 son los tipos de colágeno más abundantes dentro de la vejiga del ratón (Figura 2A). También usamos el Tabula Muris (un compendio de datos de transcriptoma de una sola célula del ratón (Mus musculus))8 para determinar el nivel de expresión de ARNM de colágenos 1, 3, 6 e hialuronano. Los datos permiten una comparación directa y controlada de la expresión génica en los tipos celulares compartidos entre los tejidos. Este análisis reveló que la expresión de estos componentes de matriz extracelular es más frecuente en los tipos de células mesenquimales en lugar de urotelio (Figura 2B).
Efecto de la disociación sobre la viabilidad de las células aisladas de la vejiga El análisis de citometría de flujo demostró que la digestión enzimática utilizando los 4 protocolos diferentes produjo viabilidad del 83%, 86%, 93% o 90%, respectivamente. Por lo tanto, la sección 3 del protocolo se consideró más valiosa para la preservación de la viabilidad celular. También observamos que aproximadamente el 4% de las células eran necróticas (PI+/Annexin V-) (Figura 4A). Estas observaciones enfatizan la eficiencia del protocolo de digestión y el consiguiente beneficio en la viabilidad celular.
Efecto de la lesión de la médula espinal en diferentes poblaciones de células de la vejiga Observamos un aumento significativo en el número total de células en vejigas de ratones SCI en comparación con los controles. El patrón de las gráficas de puntos obtenidos de las vejigas SCI también fue ligeramente diferente consistente con la remodelación continua del órgano debido a una lesión de la médula espinal(Figura 4B: primera columna). En comparación con los controles, las vejigas de los animales SCI mostraron un aumento significativo en las células CD45 positivas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Figura 1: Finalización representativa de perfusión con color aligerado del hígado. (A) Muestra el color del hígado al principio de la perfusión. (B) Muestra el color del hígado aligerado al final de la perfusión. El ratón en (A) tuvo transección de la médula espinal dos semanas antes de la perfusión, lo que resultó en hipertrofia vesical y su protuberancia fuera de la pelvis a diferencia del ratón en (B) que no tenía lesión de la médula espinal; en este caso la vejiga es pequeña y oculta en la pelvis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Figura 2: Expresión transcriptómica de componentes de matriz extracelular (ECM) en la vejiga del ratón. (A) Gráfico de barras de 43 tipos diferentes de colágeno. La expresión es indicada por Lecturas por kilobase de transcripción, por millón de lecturas mapeadas (RPKM) (los datos se recopilan de BioProject: PRJNA66167)14. (B) Tramas de violín de expresión génica en los tipos celulares obtenidos a partir de gotas microfluídicas basadas en 3'-end contando en un grupo de muestras de vejiga urinaria disociadas masculinas y femeninas (machos y hembras). Los recuentos se normalizaron de registro para cada celda utilizando el logaritmo natural de más de 1 cuenta por millón de ln(CPM+1)8. Se agregó un pseudoconteo de 1 CPM antes de tomar logaritmos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Figura 3: Estrategia de Gating y controles FMO para determinar la propagación de la fluorescencia. (A) Selección de la población celular. (B) Estrategia de Gating para singletes. (C) Gating para células apoptóticas tempranas y tardías utilizando anticuerpo PI y Annexin V. (D\u2012F) Una gráfica esquemática de citometría de flujo multicolor (por ejemplo, anticuerpos conjugados con A, B, C, D fluorochromes + (Annexin V y PI). Esto muestra la fluorescencia extendida en el anticuerpo con el canal fluorocromo A mostrado por el control FMO en comparación con un control sin manchar. La línea punteada naranja representa el límite de gating FMO en comparación con el contorno sin manchar en rojo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Figura 4: Ciclometría de flujo de diferentes tipos celulares en la vejiga. (A) Anexo gráfico de flujo de tinción doble V/PI. Las diferentes combinaciones de enzimas y productos químicos utilizados para cada protocolo se representan frente a la parcela de viabilidad correspondiente. Estos datos demuestran que la mayor viabilidad se obtuvo con la sección 3 del protocolo. B) Histogramas representativos que ilustran la intensidad de Ly-6A/E (Sca-1) y CD326 (Ep-CAM) detectados en canales individuales. (C) Efecto de SCI en la población celular de la vejiga del ratón. El panel superior muestra los resultados de la tinción en tres vejigas disociadas obtenidas de ratones no quirúrgicos de control y el panel inferior muestra los resultados de la tinción en tres animales con SCI. La primera columna es la población celular total. La segunda columna muestra la selección de gating singlet. La tercera columna muestra la subpoblación de células vivas que son negativas para las células B, las células T y las células NK. La cuarta columna muestra la tinción de las células vivas positivas para CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Importe (por 500 mL)</td>
			<td>Molaridad</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0.186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0.0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-glucosa</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1.19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Componentes para la preparación de la solución de Tyrode. Los componentes indicados son para la preparación de la solución de 500 mL Tyrode.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Cantidad</td>
			<td>Protocolo sección 1</td>
			<td>Protocolo sección 2</td>
			<td>Protocolo sección 3</td>
			<td>Protocolo sección 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno tipo I</td>
			<td>132.5 unidades</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno Tipo III</td>
			<td>96.4 unidades</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno Tipo VI</td>
			<td>50 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adnsa</td>
			<td>10 unidades</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papaína</td>
			<td>115 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Colágenonase</td>
			<td>50 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hialuronidasa</td>
			<td>10.5 unidades</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
<tr>
<td>Disipar II</td>
			<td>1.25 unidades</td>
			<td>Sí</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución de disociación celular</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enzima recombinante</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
			<td>-</td>
			<td>Sí</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Componentes para la preparación del búfer de digestión. Los componentes indicados son para la preparación de una mezcla de digestión de 2,5 ml (1 U cataliza la hidrólisis de 1 μmol un sustrato por minuto a 37 °C. Consulte la hoja de datos del producto para la definición de unidad de cada enzima).

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A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

El objetivo de este protocolo es aplicar un protocolo de disociación de tejido optimizado a un modelo de ratón de lesión de la médula espinal y validar el enfoque para el análisis de células individuales por citometría de flujo.

Un enfoque de disociación de una sola célula para el análisis molecular de la vejiga urinaria en el ratón después de la lesión de la médula espinal

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

5.4K vistas.  Boston Children's Hospital. El objetivo de este protocolo es aplicar un protocolo de disociación de tejido optimizado a un modelo de ratón de lesión de la médula espinal y validar el enfoque para el análisis de células individuales por citometría de flujo.

Video: A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Investigación

Biología

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

La microinyección de una sola célula de Análisis de Comunicación Móvil

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Medición de esfínter uretral externo cistométrico en ratas despiertas con catéter implantado y electrodos para medidas repetidas

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Aislamiento de núcleos de riñón de ratón adulto para secuenciación de ARN de un solo núcleo

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis beneath the injury site. To date, there is no functional recovery therapy for SCI, and there is a lack of clarity regarding the many complexes and dynamic events occurring after SCI. Many non-mammalian organisms can regenerate after severe SCI, such as teleost fishes, urodele amphibians, and larval stages of anuran amphibians, including Xenopus laevis tadpoles. These are bona fide model organisms to study and understand the response to SCI and the mechanisms underlying successful regenerative processes. This type of research can lead to the identification of potential targets for SCI therapeutic intervention. This article describes how to perform Xenopus laevis tadpole spinal cord transection, including husbandry, surgery, postsurgery care, and functional test evaluation. This injury method can be applied for elucidating the different steps of spinal cord regeneration by studying the cellular, molecular, and genetic mechanisms, as well as histological and functional evolution after SCI and during spinal cord regeneration.

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole spinal cord transection is a relevant injury method to study spinal cord injury and regeneration by making a transverse cut that completely severs the spinal cord at the thoracic level.

Transección de la médula espinal en renacuajos Xenopus laevis

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

Un enfoque integrado para la identificación de microproteínas y el análisis de secuencias

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...