Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01 DK077195 bis R.M.A, R01 DK104641 bis R.M.A und D.R.B) unterstützt. Wir würdigen wertvolle Beiträge von Dr. Stuart Orkin in der Abteilung für Hämatologie/Onkologie, boston Children es Hospital, Department of Pediatrics, Harvard Medical School und dem Dana-Farber Cancer Institute. Wir würdigen auch die Unterstützung von Kyle Costa bei der postoperativen Pflege von Mäusen, Mary Taglienti und Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Boston Children es Hospital, Harvard Medical School) für technische Hilfe und hilfreiche Diskussionen.

<ol>
	<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation.">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li><li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility.">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24 (2013).</li><li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway.">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+miRNA-regulated+networks,+hubs+of+signaling,+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction.">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction.">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li><li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats.">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111 (2013).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases.">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li><li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice.">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I:+architecture,+development+and+disease.">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II:+regenerative+applications.">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li><li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome.">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li></ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Das hier beschriebene Modell für die Verletzung des Rückenmarks der Maus bietet eine reproduzierbare Methode, um eine funktionelle Blasenauslassverstopfung aufgrund des Koordinationsverlusts zwischen Blasenkontraktion und externer Harnröhren-Schließmuskelentspannung zu schaffen. Dies wiederum erinnert an eine tiefgreifende Umgestaltung der Blasenwand bereits 2 Wochen nach einer Verletzung, die durch die Ausdehnung der urotheliale und glatten Muskelabteilungen gekennzeichnet ist. Kritische Schritte bei der Umsetzung des SCI-Modells bei Nagetieren sind (i) die strenge Aufmerksamkeit für die manuelle Blasenexpression während der Zeit des Wirbelsäulenschocks, die sich für 10 bis 201214 Tage nach der Verletzung ergibt; ii) anreichern, um den Gewichtsverlust zu minimieren; und (iii) Abschwächung des Potenzials für Urinverbrühungen insbesondere für Experimente, die über die Rückkehr der Reflexvoidelung hinausgehen. Zu den Einschränkungen des Modells gehören das Potenzial für Harnröhrenverschluss bei Mäusen aus Blutgerinnseln während der Zeit der transienten Hämaturie und zusätzlich bei männlichen Mäusen aus Semen koagulum nach retrograde Ejakulation nach der Operation.
Der hier beschriebene Ansatz der Gewebedissoziation veranschaulicht, wie wichtig es ist, strukturelle Veränderungen in Geweben zu berücksichtigen, die sich aus der experimentellen Beleidigung ergeben, in diesem Fall eine signifikante Gewebeumgestaltung nach GG, die nachgelagerte Analysen beeinflussen kann. Mit der Zunahme der Einzelzellanalysen ist es entscheidend sicherzustellen, dass die in der Genexpression beobachteten Unterschiede nicht einfach das Ergebnis dissoziationsinduzierter Störungen sind, sondern wirklich repräsentativ für die zugrunde liegenden biologischen Veränderungen sind, die für das Krankheitsmodell relevant sind. Die Verwendung öffentlich verfügbarer Expressionsdaten ermöglichte es uns, die Formulierung von Verdauungspuffern zu modifizieren, um eine effektive Verdauung der extrazellulären Matrix zu gewährleisten und gleichzeitig die Lebensfähigkeit zu maximieren. Weitere Modifikationen, die in zukünftigen Anwendungen in Betracht gezogen werden könnten, umfassen die Hinzufügung von Actinomycin D, um die Transkription von unmittelbaren frühen Genen zu stoppen, die empfindlich auf das Dissoziationsprotokoll15reagieren.
Pipettiertechnik ist entscheidend, wenn Gewebe getrennt oder Zellen übertragen werden, die sich bereits in Suspension befinden. Um die physische Schädigung von Zellen durch Scherkräfte zu reduzieren, ist es wichtig, während der Zellresuspension sanft und langsam Pipette zu pipette. Es wird generell empfohlen, Breitbohrpipettenspitzen zu verwenden. Bei Verwendung von Standardspitzen ist es besonders wichtig, Zellsuspensionen vorsichtig zu pipetteisieren, um Scherkräfte zu vermeiden, die sonst Zellen schädigen würden. Die Verwendung von Zellsieben ist in diesem Protokoll unvermeidbar, jedoch kann die Zellkonzentration um 20 % oder mehr sinken, begleitet von einem Volumenverlust von 100 l oder mehr. Wir empfehlen, die Zellkonzentration nach der Belastung zu bestimmen, um eine genaue Zellzahl zu gewährleisten.
In der Durchflusszytometrie liefern FMO-Kontrollen ein Maß für den Hintergrund aufgrund von Signaldurchblutungen durch überlappende Emissionsspitzen. Sie sind kein Maß für unspezifische Antikörperbindung oder Hintergrundfärbung, die vorhanden sein kann, wenn ein Antikörper in diesem Kanal enthalten ist. Um die unspezifische Antikörperbindung zu berücksichtigen, muss man geeignete Isotypkontrollen einschließen; für die Hintergrundfärbung muss man negative Kontrollen einschließen. Zusammengenommen gewährleisten diese Kontrollen eine genaue Messung der Zellpopulationen.

Störungen der normalen Harnblasenfunktion können für viele Menschen zu einer verminderten Lebensqualität führen. Um ein besseres Verständnis dafür zu erlangen, wie Verletzungen oder Krankheiten die normale Blasenfunktion entgleisen lassen, ist es wichtig, den normalen biologischen Zustand der Zellen in der Blase zu untersuchen und zu untersuchen, wie sie sich unter experimenteller Störung verändern. Bis heute sind jedoch die spezifischen Zellpopulationen, die sich in der Harnblase befinden, und wie sie sich mit Verletzungen verändern, unvollständig charakterisiert.
Einzelzell-Profilierungsmethoden wie Durchflusszytometrie oder einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) haben das Potenzial, Licht auf bestimmte Zelltypen innerhalb der Blase zu werfen. Damit diese Ansätze jedoch informatives Gewebe sind, muss es so verdaut werden, dass die Lebensfähigkeit, die Genexpression und die repräsentativen Prozentsätze der Zellpopulation des geernteten Gewebes nicht beeinträchtigt werden. Protokolle, die enzymatische Disaggregation verwenden, können die Oberflächenmarkerexpression durch wahllose Proteaseaktivität1beeinflussen und dadurch die Zellidentifikation durch Durchflusszytometrie beeinflussen, während der Dissoziationsprozess selbst zur Induktion sofortiger früher Gene führen kann, wie kürzlich von Van den Brink und Kollegen2beschrieben. Die Autoren zeigten, dass die von der Dissoziation betroffene Subpopulation zwar gering war, aber aufgrund der hohen Expressionskonzentrationen der unmittelbaren frühen Gene ein starkes Kontaminierungssignal in Massenexpressionsstudien auslösen könnte. Darüber hinaus wirkte sich die Dauer des Dissoziationsprotokolls auf die nachgewiesenen Massenexpressionsniveaus von Genen aus, die für einige Subpopulationen eindeutig waren. Daher können Einzelzell-Datasets, die ohne Berücksichtigung der Auswirkungen des Dissoziationsprotokolls generiert werden, zu Veränderungen der Genexpression führen, die sich aus der Dissoziationsmethode ergeben, im Gegensatz zur zugrunde liegenden Biologie. Diese Beobachtungen legen nahe, dass veröffentlichte Einzelzell-Transkriptomikdaten mit Vorsicht interpretiert werden sollten und dass die Ergebnisse mit unabhängigen Methoden validiert werden sollten.
Obwohl, harte und langwierige Dissoziationsmethoden können genexpression in Zellenändern 2; eine effektive Isolierung der Zellen ist unerlässlich, um eine genaue Darstellung der vorhandenen Zelltypen zu erhalten. Da die Blase ein komplexes Organ ist, das mehrere Zelltypen umfasst, können einige Populationen wie urotheliale oder stromale Zellen relativ unterrepräsentiert sein, während andere Zelltypen wie Fibroblasten innerhalb der extrazellulären Matrix existieren und eine Herausforderung darstellen können, um zu isolieren. Die Dissoziation wird noch schwieriger, wenn die Blase eine signifikante Umgestaltung und Fibrose durchlaufen hat, wie sie bei Rückenmarksverletzungen3,4 oder Blasenauslassverstopfung 5,6beobachtet wurde.
Hier beschreiben wir eine optimierte Gewebedissoziationsmethode für die nachgeschaltete Einzelzellanalyse in der Rückenmarks-Verletzten-Mausblase. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie verglichen wir vier enzymatische Verdauungsprotokolle für ihre Fähigkeit, eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die Zelllebensfähigkeit zu unterstützen und den richtigen Anteil der Zellpopulationen aufrechtzuerhalten. Basierend auf dieser Analyse kommen wir zu dem Schluss, dass die Minimierung des Zelltodes, zellulärer Aggregate, nichtzellulärer Nukleinsäuren und potenzieller Inhibitoren nachgelagerter Analysen entscheidend für die Erreichung qualitativ hochwertiger Daten ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 X Magnifying Loupes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 30-F11</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75&#34; length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75&#34; length</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type III</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 6</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS005319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 &#38; Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>V13241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer Health Care LLC,</td>
			<td>NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP</td>
			<td>2.27% Injectable Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from sheep testes, Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Inc.</td>
			<td>130-110-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4&#34; length, 0.15mm tip width</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5630</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-891-7959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115509</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD3&#949; Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100309</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100409</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100709</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108715</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116209</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 2.4G2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-7216</td>
			<td>skin protectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetropolycin eye ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>NADA # 065-016. Approved by FDA.</td>
			<td>protect eyes during anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a single cell dissociation approach for molecular analysis of urinary bladder in the mouse following spinal cord injury

Wir beschreiben die Umsetzung von Rückenmarksverletzungen bei Mäusen, um Detrusor-Sphincter-Dyssynergie, eine funktionelle Blasenauslassverstopfung und anschließende Blasenwandumbau zu entlocken. Um die Beurteilung der zellulären Zusammensetzung der Blasenwand bei nicht verletzten Kontroll- und Rückenmarks-verletzten Mäusen zu erleichtern, haben wir ein optimiertes Dissoziationsprotokoll entwickelt, das eine hohe Zelllebensfähigkeit unterstützt und die Detektion diskreter Subpopulationen durch Durchflusszytometrie ermöglicht.
Rückenmarksverletzungen entstehen durch vollständige Transsektion des Brustrückenmarks. Zum Zeitpunkt der Gewebeernte wird das Tier unter tiefer Anästhesie mit phosphatgepufferter Kochsäure durchsetzt und Blasen in Tyrodes Puffer geerntet. Gewebe werden vor der Inkubation im Verdauungspuffer gehackt, der basierend auf dem Kollagengehalt der Mausblase optimiert wurde, wie durch das Verhören öffentlich zugänglicher Genexpressionsdatenbanken bestimmt. Nach der Erzeugung einer einzelzelligen Suspension wird das Material durch Durchflusszytometrie zur Beurteilung der Zelllebensfähigkeit, der Zellzahl und spezifischer Subpopulationen analysiert. Wir zeigen, dass die Methode Zellpopulationen mit mehr als 90% Lebensfähigkeit und einer robusten Darstellung von Zellen mesenchymaler und epithelialem Ursprungs ergibt. Diese Methode ermöglicht eine genaue nachgelagerte Analyse diskreter Zelltypen in der Mausblase und möglicherweise anderen Organen.

Chirurgischer Eingriff Der Erfolg der thorakalen Rückenmarkstransektion wird durch die Bewertung einer Reihe von Parametern bestimmt, von denen der offensichtlichste die Hinterbleibslähmung ist. Das Tier bewegt sich nur mit seinen Vorderbeinen und zieht seine Hinterbeine. Ansonsten sind Aktivitätsniveaus, einschließlich Fütterung, Pflege und Wachsamkeit, in der Regel normal. Darüber hinaus verlieren die Tiere die volitionale Blasenkontrolle, was dazu führt, dass der Prüfer alle 12 Stunden eine manuelle Blasenexpression benötigt, bis die Reflexenkundung nach 10 bis 14 Tagen nach der Verletzung zurückkehrt. Nach der Euthanasie beziehen sich weitere Anzeichen für den Erfolg der Verletzung in erster Linie auf die Erhöhung des Blasen-Körper-Gewichtsverhältnisses, was auf eine Umgestaltung des Gewebes hindeutet. Die histologische Analyse zeigt Hyperplasie sowohl innerhalb der urotheliale als auch der glatten Muskelabteilungen3.
Vorbereitung der einzelzelligen Suspension Anhand öffentlich zugänglicher Expressionsdaten wurde die Anreicherung von Blasengewebe für extrazelluläre Matrixproteine bestimmt (Abbildung 2) und zur Information der Formulierung des Verdauungsmixes verwendet. Da Kollagene Schlüsselkomponenten der Blasenwand11,12sind, haben wir zunächst versucht, die am häufigsten vorkommenden Kollagene in der Mausblase mithilfe von RNA-Profiling-Datensätzen zu bestimmen, die vom Mouse ENCODE-Projekt13generiert wurden. Unsere Analyse zeigte, dass Kollagen 1A1, Kollagen 3A1, Kollagen 1A2 und Kollagen 6A1 am häufigsten Kollagentypen innerhalb der Mausblase sind (Abbildung 2A). Wir verwendeten auch das Tabula Muris (ein Kompendium von einzelzelligen Transkriptomdaten aus der Maus (Mus musculus))8, um den mRNA-Expressionsgrad von Kollagenen 1, 3, 6 und Hyaluronan zu bestimmen. Die Daten ermöglichen einen direkten und kontrollierten Vergleich der Genexpression in Zelltypen, die zwischen Geweben geteilt werden. Diese Analyse ergab, dass die Expression dieser extrazellulären Matrixkomponenten bei den mesenchymalen Zelltypen häufiger ist als in Urothelium (Abbildung 2B).
Wirkung der Dissoziation auf die Lebensfähigkeit isolierter Zellen aus der Blase Die Analyse der Durchflusszytometrie zeigte, dass die enzymatische Verdauung mit den 4 verschiedenen Protokollen eine Lebensfähigkeit von 83 %, 86 %, 93 % bzw. 90 % ergab. So wurde Protokollabschnitt 3 als am wertvollsten für die Erhaltung der Zelllebensfähigkeit angesehen. Wir beobachteten auch, dass etwa 4% der Zellen nekrotisch waren (PI+/Annexin V-) (Abbildung 4A). Diese Beobachtungen unterstreichen die Effizienz des Verdauungsprotokolls und den sich daraus ergebenden Nutzen für die Zelllebensfähigkeit.
Auswirkungen der Rückenmarksverletzung auf verschiedene Zellpopulationen in der Blase Wir beobachteten einen signifikanten Anstieg der Gesamtzellzahl in Blasen von SCI-Mäusen im Vergleich zu Kontrollen. Das Muster der Punktdiagramme, die aus SCI-Blasen gewonnen wurden, war auch etwas anders als die laufende Organumgestaltung aufgrund von Rückenmarksverletzungen(Abbildung 4B: erste Spalte). Im Vergleich zu Kontrollen zeigten die Blasen von SCI-Tieren einen signifikanten Anstieg der CD45-positiven Zellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Perfusionsvervollständigung mit aufgehellten Farbe der Leber. (A) Zeigt die Leberfarbe zu Beginn der Perfusion. (B) Zeigt die aufgehellte Leberfarbe am Ende der Perfusion. Die Maus in (A) hatte Rückenmarkstransektion zwei Wochen vor der Perfusion, was zu Blasenhypertrophie und ihrem Vorsprung aus dem Becken im Gegensatz zur Maus in (B) führte, die keine Rückenmarksverletzung hatte; in diesem Fall ist die Blase klein und im Becken versteckt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Abbildung 2: Transkriptomische Expression von komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) in der Mausblase. (A) Balkendiagramm von 43 verschiedenen Kollagentypen. Der Ausdruck wird durch Reads Per Kilobase von Transkripten, pro Million zugeordneter Lesevorgänge (RPKM) angegeben (Daten werden aus BioProject gesammelt: PRJNA66167)14. (B) Geigenplots der Genexpression in Zelltypen, die aus mikrofluidischer Tropfen-basierter 3'-End-Zählung in einem Pool von männlichen und weiblichen dissoziierten Harnblasenproben (männlich und weiblich) gewonnen werden. Die Zählungen wurden für jede Zelle mit dem natürlichen Logarithmus von 1+ Zählungen pro Million ln (CPM+1)8protokollnormalisiert. Vor der Einnahme von Logarithmen wurde eine Pseudoanzahl von 1 CPM hinzugefügt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Abbildung 3: Gating-Strategie und FMO-Kontrollen zur Bestimmung der Fluoreszenzausbreitung. (A) Auswahl der Zellpopulation. (B) Gating-Strategie für Singlets. (C) Gating für nekrotische und frühe und späte apoptotische Zellen mit PI- und Annexin-V-Antikörpern. (D-u2012F) Ein schematisches Punktdiagramm aus mehrfarbiger Durchflusszytometrie (z. B. Antikörper konjugiert mit A, B, C, D Fluorochromen + (Annexin V und PI). Dies zeigt die Fluoreszenz, die sich in den Antikörper mit Fluorchrom-A-Kanal ausbreitet, der von der FMO-Steuerung im Vergleich zu einer ungefärbten Kontrolle gezeigt wird. Orange gepunktete Linie stellt FMO-Gating-Grenze im Vergleich zu unbefleckten Grenze in rot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Abbildung 4: Durchflusszytometrie verschiedener Zelltypen in der Blase. (A) Anhang in V/PI Doppelfärbeflussdiagramme. Die verschiedenen Kombinationen von Enzymen und Chemikalien, die für jedes Protokoll verwendet werden, werden vor dem entsprechenden Lebensfähigkeitsdiagramm dargestellt. Diese Daten belegen die höchste Lebensfähigkeit, die mit Protokollabschnitt 3 ermittelt wurde. (B) Repräsentative Histogramme, die die Intensität von Ly-6A/E (Sca-1) und CD326 (Ep-CAM) veranschaulichen, die in einzelnen Kanälen nachgewiesen werden. (C) Wirkung von SCI auf die Zellpopulation der Mausblase. Obere Platte zeigt Ergebnisse der Färbung auf drei dissoziierten Blasen aus der Kontrolle nicht-chirurgische Mäuse und untere Panel zeigt die Ergebnisse der Färbung an drei Tieren mit SCI. Die erste Spalte ist die gesamte Zellpopulation. Die zweite Spalte zeigt die Singlet-Gating-Auswahl. Die dritte Spalte zeigt die Teilpopulation von lebenden Zellen, die für B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen negativ sind. Die vierte Spalte zeigt die Färbung für lebende Zellen positiv für CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
			<td>Betrag (für 500 ml)</td>
			<td>Molarität</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Komponenten zur Vorbereitung der Tyrodes-Lösung. Die angegebenen Komponenten sind für die Vorbereitung von 500 ml Tyrodes Lösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Komponente</td>
			<td>Menge</td>
			<td>Protokollabschnitt 1</td>
			<td>Protokollabschnitt 2</td>
			<td>Protokoll Abschnitt 3</td>
			<td>ProtokollAbschnitt 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ I</td>
			<td>132,5 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ III</td>
			<td>96,4 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollagenase Typ VI</td>
			<td>50 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase</td>
			<td>10 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain</td>
			<td>115 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Collagenase</td>
			<td>50 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
			<td>10,5 Stück</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1,25 Stück</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Zelldissoziationslösung</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rekombinantes Enzym</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Komponenten zur Herstellung des Verdauungspuffers. Die angegebenen Komponenten sind zur Herstellung von 2,5 ml Verdauungsmischung (1 U katalysiert die Hydrolyse von 1 mol pro Substrat pro Minute bei 37 °C. Siehe Produktdatenblatt für die Definition der Einheit jedes Enzyms).

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A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein optimiertes Gewebedissoziationsprotokoll auf ein Mausmodell der Rückenmarksverletzung anzuwenden und den Ansatz für die Einzelzellanalyse durch Durchflusszytometrie zu validieren.

Ein Einzelzell-Dissoziationsansatz für die molekulare Analyse der Harnblase in der Maus nach Einer Rückenmarksverletzung

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

5.4K Aufrufe.  Boston Children's Hospital. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein optimiertes Gewebedissoziationsprotokoll auf ein Mausmodell der Rückenmarksverletzung anzuwenden und den Ansatz für die Einzelzellanalyse durch Durchflusszytometrie zu validieren.

Serie: A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. 
We started with Cre, a 38-kDa recombinase, that recognizes a 34-bp double-stranded DNA sequence known as loxP. Because Cre can effectively eliminate genomic sequences, we set out to tailor a recombinase that could remove the sequence between the 5'-LTR and 3'-LTR of an integrated HIV-1 provirus. As a first step we identified sequences within the LTR sites that were similar to loxP and tested for recombination activity. Initially Cre and mutagenized Cre libraries failed to recombine the chosen loxLTR sites of the HIV-1 provirus. As the start of any directed molecular evolution process requires at least residual activity, the original asymmetric loxLTR sequences were split into subsets and tested again for recombination activity. Acting as intermediates, recombination activity was shown with the subsets. Next, recombinase libraries were enriched through reiterative evolution cycles. Subsequently, enriched libraries were shuffled and recombined. The combination of different mutations proved synergistic and recombinases were created that were able to recombine loxLTR1 and loxLTR2. This was evidence that an evolutionary strategy through intermediates can be successful. After a total of 126 evolution cycles individual recombinases were functionally and structurally analyzed. The most active recombinase -- Tre -- had 19 amino acid changes as compared to Cre. Tre recombinase was able to excise the HIV-1 provirus from the genome HIV-1 infected HeLa cells (see "HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Germany). While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of "molecular surgery" and molecular medicine.

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within the LTR sequences of the HIV-1 provirus, resulting in the excision and eradication of the provirus from infected human cells. While still in its infancy, directed molecular evolution will allow the creation of custom enzymes that will serve as tools of molecular surgery and molecular medicine.

Molekulare Evolution der Tre-Rekombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Forschung

Biologie

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord Elektrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Einzel-Zell-Saug-Recordings aus Maus Zapfen-Photorezeptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Einzellige Mikroinjektions für Zellkommunikationsanalyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Zystometrischen und externen urethralen Sphincter Messungen in wach Ratten mit implantierten Katheter und Elektroden für wiederholte Messungen

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

Ein Protokoll für Labor Housing von Türkis Killifische (Nothobranchius Furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...