Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01 DK077195'ten R.M.A'ya, R01 DK104641'den R.M.A ve D.R.R..B'a) verilen hibelerle desteklendi. Hematoloji/Onkoloji Bölümü, Boston Çocuk Hastanesi, Pediatri Bölümü, Harvard Tıp Fakültesi ve Dana-Farber Kanser Enstitüsü'nde Dr. Stuart Orkin'in değerli katkılarını kabul ediyoruz. Ayrıca Kyle Costa'nın farelerin ameliyat sonrası bakımında, Mary Taglienti ve Dr. Habiballah Shojaeisaadi'nin (Dr. Yang Shi Laboratuvarı, Pediatri Bölümü, Yenidoğan Tıbbı Bölümü, Pediatri Bölümü, Yenidoğan Tıbbı Bölümü, Boston Çocuk Hastanesi, Harvard Tıp Fakültesi) teknik yardım ve yararlı tartışmalar için desteğini kabul ediyoruz.

<ol>
	<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation.">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li><li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility.">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24 (2013).</li><li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway.">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+miRNA-regulated+networks,+hubs+of+signaling,+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction.">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction.">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li><li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats.">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111 (2013).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases.">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li><li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice.">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I:+architecture,+development+and+disease.">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II:+regenerative+applications.">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li><li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome.">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li></ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Burada açıklanan fare omurilik yaralanması modeli, mesane kasılması ve dış üretral sfinkter gevşemesi arasındaki koordinasyon kaybı nedeniyle fonksiyonel bir mesane çıkış tıkanıklığı oluşturmak için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu da, ürotelial ve düz kas bölmelerinin genişlemesi ile karakterize edilen yaralanmadan 2 hafta sonra mesane duvarının derin tadilatını çağrıştırır. Kemirgenlerde SCI modelinin uygulanmasında kritik adımlar şunlardır: (i) yaralanmadan sonraki 10\u201214 gün boyunca ortaya çıkan omurga şoku döneminde manuel mesane ifadesine titizlikle dikkat etmek; (ii) kilo kaybını en aza indirmek için besin zenginleştirme; ve (iii) özellikle refleks geçersiz kılmanın geri dönüşünün ötesine geçen deneyler için idrar haşlama potansiyelinin azaltılması. Modelin sınırlamaları, geçici hematüri döneminde kan pıhtılarından farelerde üretral tıkanıklık potansiyelini ve ayrıca ameliyattan sonra retrograd boşalmayı takiben meni pıhtısından erkek farelerde bulunur.
Burada açıklanan doku ayrıştırma yaklaşımı, deneysel hakaretten kaynaklanan dokulardaki yapısal değişiklikleri göz önünde bulundurmanın önemini göstermektedir, bu durumda SCI'yı takiben aşağı akış analizlerini etkileyebilecek önemli doku tadilatı. Tek hücreli analizlerdeki artışla, gen ifadesinde gözlenen farklılıkların sadece ayrışmaya bağlı pertürbasyonların bir sonucu olmadığından, hastalık modeliyle ilgili temel biyolojik değişiklikleri gerçekten temsil ettiğinden emin olmak önemlidir. Herkese açık ifade verilerinin kullanımı, canlılığı en üst düzeye çıkarırken hücre dışı matrisin etkili bir şekilde sindirilmesini sağlamak için sindirim tamponlarının formülasyonunu değiştirmemize izin sağladı. Gelecekteki uygulamalarda dikkate alınabilecek ek değişiklikler, ayrışma protokolüne duyarlı acil erken genlerin transkripsiyonunu durdurmak için aktinomycin D eklenmesini içerir15.
Pipetleme tekniği, dokuyu ayrıştırırken veya zaten süspansiyonda olan hücreleri aktarırken çok önemlidir. Kesme kuvvetlerinden hücrelere fiziksel hasarı azaltmak için, hücre resüspensiyonu sırasında yavaşça ve yavaşça pipet yapmak önemlidir. Genellikle geniş delikli pipet uçlarının kullanılması önerilir. Standart uçlar kullanıyorsanız, aksi takdirde hücrelere zarar verecek kesme kuvvetlerini önlemek için hücre süspansiyonlarını yavaşça pipetlamak özellikle önemlidir. Hücre süzgeçlerinin kullanılması bu protokolde kaçınılmazdır, ancak hücre konsantrasyonu 100 μL veya daha fazla hacim kaybı eşliğinde% 20 veya daha fazla azalabilir. Kesin bir hücre sayısı sağlamak için hücre konsantrasyonunun süzüldikten sonra belirlenmesini öneririz.
Akış sitometrisinde, FMO kontrolleri üst üste binen emisyon tepelerinden gelen sinyalin kanaması nedeniyle bir arka plan ölçüsü sağlar. Bunlar spesifik olmayan antikor bağlama veya bu kanala bir antikor dahil edildiğinde bulunabilecek arka plan boyama ölçüsü değildir. Spesifik olmayan antikor bağlamasını hesaba katmak için uygun izotip kontrollerini dahil etmek zorundadır; arka plan boyama için negatif kontroller dahil edilmesi gerekir. Birlikte ele alındığında, bu kontroller hücre popülasyonlarının doğru ölçümünü sağlar.

Normal idrar kesesi fonksiyonunun pertürbasyonları birçok birey için yaşam kalitesinin düşmesine neden olabilir. Yaralanmanın veya hastalığın normal mesane fonksiyonunu nasıl raydan çıkardığını daha iyi anlamak için, mesane içindeki hücrelerin normal biyolojik durumunu ve deneysel pertürbasyon altında nasıl değiştiklerini araştırmak önemlidir. Bununla birlikte, bugüne kadar, idrar kesesi içinde bulunan spesifik hücre popülasyonları ve yaralanma ile nasıl değiştikleri eksik karakterize edilmiştir.
Akış sitometrisi veya tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi tek hücreli profil oluşturma yöntemleri mesane içindeki belirli hücre tiplerine ışık tutma potansiyeline sahiptir. Ancak bu yaklaşımların bilgilendirici doku olabilmesi için hasat edilen dokunun canlılığını, gen ekspresyonlarını ve temsili hücre popülasyon yüzdelerini etkilemeyecek şekilde sindirilmesi gerekmektedir. Enzimatik ayrışma kullanan protokoller, ayrımsız proteaz aktivitesi1aracılığıyla yüzey işaretleyici ekspresyonunu etkileyebilir, böylece akış sitometrisi ile hücre tanımlamasını etkileyebilir, ancak ayrışma sürecinin kendisi, van den Brink ve meslektaşları tarafından yakın zamanda açıklandığı gibi, hemen erken genlerin indüksiyona yol açabilir2. Yazarlar, ayrışma etkisindeki alt nüfus küçük olmasına rağmen, hemen erken genlerin yüksek ekspresyon seviyeleri nedeniyle toplu ifade çalışmalarında güçlü bir kontamine sinyali tetikleyebileceğini göstermiştir. Ek olarak, ayrışma protokolünün süresi, bazı alt nüfuslara özgü olduğu gösterilen genlerin algılanan toplu ekspresyon seviyelerini etkiledi. Bu nedenle, ayrışma protokolünün etkisi hesaba katmadan oluşturulan tek hücreli veri kümeleri, alttaki biyolojinin aksine, ayrışma yönteminden kaynaklanan gen ekspresyon değişiklikleri sağlayabilir. Bu gözlemler, yayınlanan tek hücreli transkriptomik verilerin dikkatle yorumlanıp sonuçların bağımsız yöntemlerle doğrulanmış olması gerektiğini göstermektedir.
Her ne kadar sert ve uzun ayrışma yöntemleri hücrelerde gen ekspresyonunu değiştirebilir2; hücrelerin etkili izolasyonu, mevcut hücre tiplerinin doğru temsilini elde etmek için gereklidir. Mesane birden fazla hücre tipinden oluşan karmaşık bir organ olduğundan, ürotelial veya stromal hücreler gibi bazı popülasyonlar nispeten az temsil edilebilirken, fibroblastlar gibi diğer hücre tipleri hücre dışı matris içinde bulunur ve izole edilmesi zor olabilir. Mesane, omurilik yaralanması 3 ,4 veya mesane çıkış tıkanıklığı5,6'dagözlenen gibi önemli bir tadilat ve fibrozis geçirmişse, ayrışma daha da zorlaşır.
Burada, omurilik yaralı fare mesanesinde aşağı akış tek hücre analizi için optimize edilmiş bir doku ayrıştırma yöntemini açıklıyoruz. Akış sitometrisini kullanarak, tek bir hücre süspansiyonu verme, hücre canlılığını destekleme ve hücre popülasyonlarının doğru oranını koruma yetenekleri için dört enzimatik sindirim protokolünü karşılaştırdık. Bu analize dayanarak, hücre ölümünü, hücresel agregaları, hücresel olmayan nükleik asitleri ve aşağı akış analizinin potansiyel inhibitörlerini en aza indirmenin yüksek kaliteli verilere ulaşmak için kritik öneme sahip olduğu sonucuna varıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 X Magnifying Loupes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 30-F11</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75&#34; length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75&#34; length</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type III</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 6</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS005319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 &#38; Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>V13241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer Health Care LLC,</td>
			<td>NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP</td>
			<td>2.27% Injectable Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from sheep testes, Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Inc.</td>
			<td>130-110-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4&#34; length, 0.15mm tip width</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5630</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-891-7959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115509</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD3&#949; Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100309</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100409</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100709</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108715</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116209</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 2.4G2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-7216</td>
			<td>skin protectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetropolycin eye ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>NADA # 065-016. Approved by FDA.</td>
			<td>protect eyes during anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a single cell dissociation approach for molecular analysis of urinary bladder in the mouse following spinal cord injury

Detrusor-sfinkter disserjisi, fonksiyonel bir mesane çıkış tıkanıklığı ve daha sonra mesane duvarı tadilatı yapmak için farelerde omurilik hasarının uygulanmasını tarif ediyoruz. Yaralanmamış kontrol ve omurilik yaralı farelerde mesane duvarının hücresel bileşiminin değerlendirilmesini kolaylaştırmak için, yüksek hücre canlılığını destekleyen ve akış sitometrisi ile ayrık alt nüfusların tespitini sağlayan optimize edilmiş bir ayrışma protokolü geliştirdik.
Omurilik yaralanması torasik omuriliğin tamamen transeksiyonu ile oluşturulur. Doku hasadı sırasında, hayvan derin anestezi altında fosfat tamponlu salin ile perfüzyona edilir ve mesaneler Tyrode'un tamponuna toplanır. Dokular, halka açık gen ekspresyon veritabanlarının sorgulanmasıyla belirlenen fare mesanesinin kollajen içeriğine göre optimize edilmiş sindirim tamponunda inkübasyondan önce kıyılır. Tek hücreli süspansiyonun üretilmesinden sonra, malzeme hücre canlılığının, hücre sayısının ve spesifik alt nüfusların değerlendirilmesi için akış sitometrisi ile analiz edilir. Yöntemin% 90'dan fazla canlılığa sahip hücre popülasyonları ve mezenkimal ve epitel kökenli hücrelerin sağlam bir şekilde temsilini sağladığını gösteriyoruz. Bu yöntem, fare mesanesinde ve potansiyel olarak diğer organlarda ayrı hücre tiplerinin doğru aşağı akış analizini sağlayacaktır.

Cerrahi prosedür Torasik omurilik transeksiyonunun başarısı, en belirgin olanı hindlimb felci olan bir dizi parametrenin değerlendirilmesi ile belirlenir. Hayvan sadece ön ayaklarını kullanarak hareket eder, arka ayaklarını sürükler. Aksi takdirde, beslenme, tımar ve uyanıklık da dahil olmak üzere aktivite seviyeleri genellikle normaldir. Ek olarak, hayvanlar iradesel mesane kontrolünü kaybeder ve bu da yaralanmadan 10 ila 14 gün sonra refleks geçersiz kılma geri dönene kadar her 12 saat içinde araştırmacı tarafından manuel mesane ifadesine ihtiyaç duyar. Ötenazi sonrasında, yaralanmanın başarısının ek belirtileri öncelikle doku tadilatının göstergesi olan mesane-vücut ağırlık oranındaki artışla ilgilidir. Histolojik analiz, hem ürotelial hem de düz kas bölmeleri içinde hiperplaziyi ortaya koymaktadır3.
Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması Halka açık ekspresyon verileri kullanılarak, hücre dışı matris proteinleri için mesane dokusunun zenginleştirilmesi belirlendi (Şekil 2) ve sindirim karışımının formülasyonunu bilgilendirmek için kullanıldı. Kollajenler mesane duvarının anahtar bileşenleri olduğundan11,12, ilk önce Fare ENCODE projesi13tarafından oluşturulan RNA profil oluşturma veri kümelerini kullanarak fare mesanesinde en bol kolajenleri belirlemeye çalıştık. Analizimiz Kollajen 1A1, kollajen 3A1, kollajen 1A2 ve kollajen 6A1'in fare mesanesi içindeki en bol kollajen türleri olduğunu göstermiştir (Şekil 2A). Ayrıca 1,3, 6 ve hyaluronan kollajenlerinin mRNA ekspresyon seviyesini belirlemek için Tabula Muris (fareden (Mus musculus)) 8'den tek hücreli transkriptom verilerinin bir toplamı) kullandık. Veriler, dokular arasında paylaşılan hücre tiplerinde gen ekspresyonunun doğrudan ve kontrollü bir şekilde karşılaştırılmasını sağlar. Bu analiz, bu hücre dışı matris bileşenlerinin ekspresyonunun ürotelyum yerine mezenkimal hücre tiplerinde daha yaygın olduğunu ortaya koydu (Şekil 2B).
Ayrışmanın izole hücrelerin mesaneden yaşayabilirliği üzerindeki etkisi Akış sitometrisi analizi, 4 farklı protokol kullanılarak enzimatik sindirimin sırasıyla% 83, % 86, % 93 veya% 90 canlılık sağladığını göstermiştir. Bu nedenle, protokol bölüm 3 hücre canlılığının korunması için en değerli görülmüştür. Ayrıca hücrelerin yaklaşık % 4'ünün nekrotik olduğunu gözlemledik (PI+/ Annexin V-) (Şekil 4A). Bu gözlemler sindirim protokolünün verimliliğini ve hücre canlılığı üzerindeki faydayı vurgular.
Omurilik hasarının mesanedeki farklı hücre popülasyonları üzerindeki etkisi SCI farelerinin mesanelerindeki toplam hücre sayısında kontrollere göre önemli bir artış gözlemledik. SCI mesanelerinden elde edilen nokta çizgilerinin deseni de omurilik yaralanması nedeniyle devam eden organ tadilatı ile biraz farklıydı(Şekil 4B: ilk sütun). Kontrollerle karşılaştırıldığında, SCI hayvanlarından elde edilen mesaneler CD45 pozitif hücrelerde önemli bir artış gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Şekil 1: Karaciğerin hafifletilmiş rengi ile temsili perfüzyon tamamlama. (A) Perfüzyonun başlangıcındaki karaciğer rengini gösterir. (B) Perfüzyon sonunda hafifletilmiş karaciğer rengini gösterir. (A)'daki fare, perfüzyondan iki hafta önce omurilik transeksiyonu geçirdi ve mesane hipertrofisine ve omurilik yaralanması olmayan farenin (B) aksine pelvisten çıkıntısına neden oldu; Bu durumda mesane küçüktür ve pelviste gizlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Şekil 2: Fare mesanesinde hücre dışı matris (ECM) bileşenlerinin transkriptomik ekspresyonu. (A) 43 farklı kollajen tipinin çubuk grafiği. İfade, transkriptin Kilobase Başına Okuma, milyon eşlenen okuma başına (RPKM) ile belirtilir (veriler BioProject' ten toplanır: PRJNA66167)14. (B) Erkek ve dişi ayrışmış idrar kesesi örnekleri havuzunda (erkek ve dişi) mikroakışkan damlacık bazlı 3'uç sayımından elde edilen hücre tiplerinde gen ekspresyonunun keman çizimleri. Sayımlar, milyon ln (CPM+1)8başına 1+ sayının doğal logaritmini kullanarak her hücre için günlük normalleştirildi. Logaritma almadan önce 1 CPM'lik bir sözde sayı eklendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Şekil 3: Floresan yayılımlarını belirlemek için gating stratejisi ve FDO kontrolleri. (A) Hücre popülasyonu seçimi. (B) Singlet'lar için gating stratejisi. (C) PI ve Annexin V antikoru kullanılarak nekrotik ve erken ve geç apoptotik hücreler için gating. (D\u2012F) Çok renkli akış sitometrisinin şematik nokta grafiği (örneğin, A, B, C, D florokromları + (Ek V ve PI) ile eşleştirilmiş antikorlar). Bu, floresanların FDO kontrolü tarafından gösterilen florokrom A kanalı ile antikora yayıldığını gösterir. Turuncu noktalı çizgi, kırmızı renkteki lekesiz sınıra kıyasla FMO geçiş sınırını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Şekil 4: Mesanede farklı hücre tiplerinin akış sitometrisi. (A) Annexin V/PI çift boyama akış şemaları. Her protokol için kullanılan farklı enzim ve kimyasal kombinasyonları, ilgili canlılık grafiğinin önünde temsil edilir. Bu veriler protokol bölüm 3 ile en yüksek canlılığı göstermektedir. (B) Tek kanallarda tespit edilen Ly-6A/E (Sca-1) ve CD326 (Ep-CAM) yoğunluğunu gösteren temsili histogramlar. (C) SCI'nın fare mesanesinin hücre popülasyonu üzerindeki etkisi. Üst panel, kontrol ameliyatsız farelerden elde edilen üç ayrışmış mesanede lekeleme sonuçlarını gösterir ve alt panel SCI'lı üç hayvanda lekelemenin sonuçlarını gösterir. İlk sütun toplam hücre popülasyonudur. İkinci sütunda singlet gating seçimi gösterilir. Üçüncü sütun, B hücreleri, T hücreleri ve NK hücreleri için negatif olan canlı hücrelerin alt nüfusunu gösterir. Dördüncü sütun, CD45 için pozitif canlı hücreler için boyama gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Tutar (500 mL için)</td>
			<td>Azı dişi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kartal</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glikoz</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Tyrode'un çözeltisinin hazırlanması için bileşenler. Belirtilen bileşenler 500 mL Tyrode çözeltisinin hazırlanması içindir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bileşen</td>
			<td>Tutar</td>
			<td>Protokol bölüm 1</td>
			<td>Protokol bölüm 2</td>
			<td>Protokol bölüm 3</td>
			<td>Protokol bölüm 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollajenaz Tip I</td>
			<td>132,5 adet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollajenaz Tip III</td>
			<td>96,4 adet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kollajenaz Tip VI</td>
			<td>50 adet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase</td>
			<td>10 adet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain</td>
			<td>115 adet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Kollajenaz</td>
			<td>50 adet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidaz</td>
			<td>10,5 adet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1.25 adet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hücre ayrıştırma çözümü</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rekombinant enzim</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
			<td>-</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Sindirim tamponunun hazırlanması için bileşenler. Belirtilen bileşenler 2,5 mL sindirim karışımının hazırlanması içindir (1 U, dakikada 37 °C'de bir substrat olan 1 μmol'ün hidrolizini kataliz eder. Her enzimin biriminin tanımı için ürün veri sayfasına bakın).

Watch this Scientific Journal Video about A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury at JoVE.com

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Bu protokolün amacı, omurilik hasarının fare modeline optimize edilmiş bir doku ayrıştırma protokolü uygulamak ve akış sitometrisi ile tek hücre analizi yaklaşımını doğrulamaktır.

Omurilik Yaralanmasını Takiben Faredeki İdrar Kesesinin Moleküler Analizi için Tek Hücreli Ayrışma Yaklaşımı

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

5.4K Görüntüleme.  Boston Children's Hospital. Bu protokolün amacı, omurilik hasarının fare modeline optimize edilmiş bir doku ayrıştırma protokolü uygulamak ve akış sitometrisi ile tek hücre analizi yaklaşımını doğrulamaktır.

Video: A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biyoloji

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

Cystometric ve dış üretral sfinkter ölçümleri implant kateter ve tekrarlanan ölçülerini izin elektrotları ile uyanık Sıçanlarda

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebra balığı adacıkları tek hücreli çözünürlük kalsiyum Imaging'i kullanma Beta hücre fonksiyonu Analizi

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Tek Çekirdekli RNA Dizilimi için Yetişkin Fare Böbreğinden Çekirdek İzolasyonu

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis beneath the injury site. To date, there is no functional recovery therapy for SCI, and there is a lack of clarity regarding the many complexes and dynamic events occurring after SCI. Many non-mammalian organisms can regenerate after severe SCI, such as teleost fishes, urodele amphibians, and larval stages of anuran amphibians, including Xenopus laevis tadpoles. These are bona fide model organisms to study and understand the response to SCI and the mechanisms underlying successful regenerative processes. This type of research can lead to the identification of potential targets for SCI therapeutic intervention. This article describes how to perform Xenopus laevis tadpole spinal cord transection, including husbandry, surgery, postsurgery care, and functional test evaluation. This injury method can be applied for elucidating the different steps of spinal cord regeneration by studying the cellular, molecular, and genetic mechanisms, as well as histological and functional evolution after SCI and during spinal cord regeneration.

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole spinal cord transection is a relevant injury method to study spinal cord injury and regeneration by making a transverse cut that completely severs the spinal cord at the thoracic level.

Xenopus laevis Kurbağa Yavruları'nda Omurilik Transeksiyonu

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

Mikroprotein Tanımlama ve Dizi Analizi için Entegre Bir Yaklaşım

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...