smFISHは、mRNAの細胞下位置として絶対数を測定するために知られています。当社の2色sMFISHプロトコルは、転写およびmRNA分解の運動を測定する追加機能を有する。この方法を使用すると、余分な時間や労力をかけずに多くのサンプルを同時に処理できます。
例えば、48サンプルを得る4つのタイムコース実験は、8時間でイメージングのために処理することができる。当社のプロトコルは、多くの遺伝子や細菌種に広く適用されます。実験用のカバースリップとガラススライドを準備する。
100%エタノールを含むコプリン瓶にカバースリップとスライドを入れ、15〜20分間水浴超音波ケータリングに瓶を置くために鉗子を使用してください。超音波処理の終わりにスライドを洗浄し、70%エタノールで瓶を補充し、超音波処理を繰り返す前に、超純水で3〜4回スリップカバー。すべての超音波処理ステップが完了したら、カバースリップを乾燥させ、窒素ガスでスライドします。
カバースリップを空の1000マイクロリットルピペットチップボックスに入れ、スライドをきれいなスライドボックスに入れます。次いで、ピペットチップボックスの穴に続いて、疎水性マーカーを使用してカバースリップに円を描き、これらのウェルのそれぞれに0.1%Poly lリジンの20マイクロリットルのドロップを適用します。タイムコース実験を設定するには、指数関数的に成長している20ミリリットルの大腸菌培養物から、タイムゼロとマークされた1.5ミリリットルの培養チューブに750マイクロリットルを加えます。
そしてすぐに管を反転する。0.2 から 1 ミリモル IPTG で lac Z の発現を誘導し、タイマーを開始します。タイマーを確認した後、ちょうど示したように、連続した実験時点の細胞培養を収集する。
実験中の適切な時点で、フラスコに5ミリモルONPFを加え、lac Z発現を抑制し、培養物をサンプリングし続けてmRNA分解を追跡する。タイムコースサンプルの取得終了時に、室温でサンプルを15分間インキュベートし、氷上で30分間インキュベーションします。インキュベーション遠心分離機の終わりには、固定剤を除去し、ピペットを使用して上清を除去するためにサンプルを遠心分離する。
DEPC PBSの1ミリリットルで細菌を再懸濁し、洗浄ごとに新鮮なDEPC PBSの1ミリリットルでさらに2回細胞を洗浄します。最後の洗浄後、新鮮なDEPC PBSの30マイクロリットルで細胞を再懸濁します。細胞の透過性のため。
まず、エタノール滅菌ガラスカバースリップの1つに個々の疎水性井戸に各時間ポイントからサンプルを追加します。そして、細胞が室温で10〜30分のインキュベーションでカバースリップに付着するようにします。インキュベーションの終わりに、各ウェルに70%エタノールの15マイクロリットルを加えます。
4分後、各ウェルからエタノールを吸引し、井戸が完全に乾燥するようにする。洗浄後、透過化された細胞の各ウェルに30マイクロリットルのプレハイブリダイゼーション溶液を加え、37°Cのオーブンで30分間培養します。プレハイブリダイゼーション溶液をウェルあたり約30マイクロリットルのプローブハイブリダイゼーション溶液に置き換えます。
そして37°Cのオーブンで2時間のインキュベーションのためのアルミニウムホイルで部屋をカバーする。インキュベーションの最後に、マルチチャンネルピペットを使用して、洗浄ごとに30マイクロリットルの洗浄液でウェルを3〜5回洗い流します。最後の洗浄の後、37°Cで15〜30分間細胞をインキュベートしてから、1回の洗浄ごとに30マイクロリットルの新鮮なDEPC PBSで井戸を5回洗浄します。
最後の洗浄後、カバースリップからすべての液体を吸引します。そして、各井戸に新鮮なDEPC PBSの4マイクロリットルを追加します。鉗子を使用して、カバースリップをエタノール滅菌ガラススライドサンプル側の下に慎重に置き、シリコーンデンタルガムを使用してカバースリップの端を密封します。
対象領域を特定するには、位相コントラストイメージングのライブモードを選択し、井戸内の視野を変更するためにステージジョイスティックを操作します。位相コントラストのセル画像が焦点を合わせ、Zフォーカスを調整して最適な領域に位置する。次に、4秒露光を伴うC 5画像、2秒露光を伴うC3画像、およびウェルあたり約10の異なる領域に対して0.2秒の露出を有する位相コントラスト画像を取得する。
あるいは、直列にC5、C3及び位相コントラスト画像が取得されるNDI取得を実行することができる。すべてのウェルがイメージ化されたら、適切なセルセグメンテーションツールを開き、スタックをクリック解除します。対象の位相コントラスト画像をロードして独立したフレームを選択し、フェーズプロファイルをゼロとして計算します。
セルが識別され、それらの輪郭が計算されるセグメント化プロセスを開始します。GitHub フォルダーに指定されたパラメーターを読み込み、すべてのフレームをクリックします。処理の最後に輪郭を選択してメッシュを視覚化します。
次に、スポット検出タブで、スタックをオフにし、メッシュをチェックし、2つのDガウスフィッティングに基づいてスポット識別と定量を開始するためにこすりをクリックします。蛍光画像と、細胞検出手順から計算したメッシュファイルを含むフォルダを選択し、スポット検出結果を保存するファイル名を指定します。次に、GitHub で提供されている画像分析ワークフローを使用して、蛍光画像を分析します。
この全視野では、細胞のセグメンテーションに適した密度で約500個の大腸菌細胞が観察できる。位相コントラスト画像の細胞の形態は、セグメンテーション目的で生細胞の形態と同等であり続けるべきである。細胞が透過性を超える場合、その形態はセグメンテーションには適さない。
誘導前のラックZ mRNAスポット強度の分布は、高強度のスポットの存在により、正常分布またはポアソン分布とは適合しません。ラックZの発現が誘導されると、3つのプライムラックZmRNAシグナルが増加する前に5つのプライムラックZmRNAのシグナルが増加する。ラックZの発現が抑圧された場合、5個と3つのプライムラックZmRNAシグナルが減少する。
転写伸長の速度を得るために、5および3つの主要信号の上昇は線に適合する。mRNA分解の速度は、指数関数を有する崩壊領域を適合させることによって得られる。単一分子魚は単一細胞の技術であるため、転写における細胞間の変動性も分析できる。
さらに、5つの素数と3つのプライムラックZ mRNAの共局在化の分析により、lac Z遺伝子上のRNAポリメラーゼの密度を定量化することができます。異なる時間ポイントからのサンプルは、この手順の間に同時に処理されます。チューブとカバースリップの間、サンプルを分離しておくことが重要です。
この単一分子単一細胞顕微鏡法を用いた。研究者は、トランスクリプションおよびmRNA分解動態がmRNAの絶対数または細胞内位置にどのように関連しているかを調べることができます。
