幹細胞教育者療法は、I型糖尿病および他の自己免疫疾患を治療するために開発されました。この方法は、CB-SC放出エキソソームを通じて幹細胞教育療法の免疫モデレーションの基礎となる分子メカニズムを探求するために開発された。このプロトコルは、ヒト臍帯血幹細胞培養物からエキソソームを精製し、単球の免疫調節を決定する方法についてのガイダンスを提供する。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生であるWei Huです。まず、CB-SC由来のコンディション培地をテキスト原稿に記載した3回遠心分離し、各遠心分離後に上清を新しい50ミリリットル円錐形管に集める。第3遠心分離後、得られた上清を0.22マイクロリットルのフィルターで濾過し、15ミリリットルの培地を各10キロダルトン遠心フィルター装置に移します。
遠心分離機は4,000xgで30分間、濃縮エキソソーム培地を分離する。濃縮エキソソームを超遠心チューブに移します。その後、エキソソームを摂氏4度で80分間100,000xgでペレット化する。
その後、上清を捨て、PBSの10ミリリットルでペレット化エキソソームを再懸濁します。最終的な超遠心分離を行い、エキソメペレットを回収し、PBSの200マイクロリットルで再懸濁します。摂氏4度で10分間、300xgの15ミリリットルチューブと遠心分離機に3,000万個のヒトPBMCを加えます。
冷たいPBSの300マイクロリットルで細胞を再懸濁し、CD14マイクロビーズの60マイクロリットルを追加します。よく混ぜて、15分間氷の上の細胞をインキュベートします。冷たいPBSと遠心分離機を摂氏4度で10分間300xgでさらに6ミリリットル加えます。
次に、ペレット化された細胞を500マイクロリットルのコールドランニングバッファーに再懸濁します。分離カラムをマグネットセパレータに入れ、2ミリリットルのコールドランニングバッファで3回洗います。再中断した細胞を分離列に移し、通過させます。
繰り返しますが、1回の洗浄ごとに2ミリリットルのランニングバッファでカラムを3回洗います。次に、マグネットセパレータから柱を持ち上げ、氷の上に15ミリリットルの遠心管の上に置きます。2ミリリットルのコールドランニングバッファーを持つCD14陽性細胞をエルテし、300 x gで摂氏4度で10分間遠心して細胞をペレット化する。
ペレットを2ミリリットルの冷たい化学定義血清培地で再懸濁し、50マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移します。得られた細胞を、10マイクロリットルのクロームオレンジ共役抗ヒトCD14モノクローナル抗体を20分間染色する。細胞をペレットにするために300 x gでPBSと遠心分離機を1ミリリットル加えます。
細胞ペレットをPBSの200マイクロリットルに再懸濁し、5ミリリットルのチューブに移します。フローサイトメトリーによりCD14+単球の純度を測定します。得られた精製単球の種子100万は、6ウェルプレートを処理し、5%の二酸化炭素の下で摂氏37度で2時間インキュベートする。
インキュベートを廃棄し、37度の事前温められた化学物質定義された血清不全培養培地の2ミリリットルを穏やかに加え、その後、CB-SC由来エキソソームの80マイクログラムを6ウェルプレートの単球培養物に加え、総容量は2ミリリットルである。5%の二酸化炭素の下で37°Cでプレートを3〜4日間インキュベートします。次に、200倍の倍率で反転顕微鏡を使用して細胞形態を画像化します。
PBSベースの細胞解離バッファーを1ミリリットル加え、上下にピペット処理して細胞を取り外し、残りの細胞を細胞スクレーパーで収穫します。1,690 x gで5分間遠心分離して細胞を回収し、200マイクロリットルのPBSで再懸濁します。FCブロッカーを5マイクロリットル加え、非特異的結合をブロックし、抗体を追加します。
室温で30分間培養します。インキュベートされた細胞にPBSを1ミリリットル加え、300 x gで10分間遠心分離します。PBSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁し、サンプルあたり5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムを添加する。
細胞を新しい5ミリリットルのフローチューブに移し、フローサイトメトリーを行い、CD14、CD80、CD86、CD163、CD206、およびCD209発現のレベルを評価します。CB-SCの表現型および純度を、CB-SC関連マーカーを用いたフローサイトメトリーによって調べた。この分析では、CD45、OCT3/4、SOX2、CD270およびガレクチン9の発現は高レベルであったが、CD34の発現は認められなかった。
フローサイトメトリー解析では、CB-SC由来エキソソーム上のエキソーム特異的マーカー、CD9、CD81、およびCD63の発現も確認できます。エキソソームのサイズ形態はTEMによって特徴付け、サイズ分布はDLSによって決定された。ウェスタンブロットは、ER関連マーカー、カルネキシンの発現を伴わないエキソメ関連マーカーアリックスの発現をさらに証明する。
ジオ標識CB-SC-ExoとPBMCの直接相互作用は、蛍光顕微鏡を用いて観察された。CB-SC-Exoとラベル付けされたダイヤルと相互作用する細胞集団をより良く定義するために、異なる細胞コンパートメントは、T細胞用CD3、骨髄樹状細胞用CD11C、単球用CD14、B細胞用CD19、NK細胞用CD56などの細胞特異的マーカーでゲート付けされた。単球は、他の免疫細胞よりも高い中央値蛍光強度を示したため、主にCB-SC由来のエキソソームによって標的とされた。
エキソソームは単球をスピンドル様形態に分化し、正常に分化した。CB-SC由来エキソソームによる治療後、CD163、CD206、CD209などのM2関連マーカーのレベルに上位調節があった。従来のM2マクロファージとCB-SC外発性M2マクロファージとの間のフェノミカル比較は有意差を示さなかった。
このプロトコルの重要なステップは、CB-SC由来エキソソームを6ウェルプレートの培養物に追加し、3〜4日間インキュベートすることです。次に、2型マクロファージへの単球の分化誘導に寄与したCB-SC由来エキソソーム内部の分子成分を探る。
