0.私たちのプロトコルは、破骨細胞をin vitroで生成するための最適化された再現性のある方法を説明しており、それらの分化プロセスと機能の根底にあるメカニズムを調査するために使用できるものです。この技術の主な利点は、わずか1週間以内に多数の機能的に活性な破骨細胞を生成できることです。精製された単球を使用し、サイトカインを時間通りに添加することにより、高い分化収率が達成されます。
破骨細胞はあらゆる形態の関節炎の骨破壊に関与しており、この方法は、それらの分化および/または機能を調節することができる新しい治療用化合物をスクリーニングするためのツールを提供します。手順を実演するのは、私たちの研究室の博士課程の学生であるパトリシア・リードロワです。まず、血液を新しい50ミリリットルのチューブに移してPBMCを分離します。
新鮮な血液の場合は等量の滅菌PBSで、白血球コーンとバフィーコートの場合は1:3の比率で希釈します。反転によって血液を穏やかに混ぜます。3ミリリットルの密度勾配培地を含む15ミリリットルのチューブを準備し、混合を避けて、密度勾配培地の上に8〜10ミリリットルの希釈血液をゆっくりと重ねます。
チューブを400 x gで室温で30分間、ブレーキなしで遠心分離します。次に、パスツールピペットで最上層を慎重に廃棄します。PBMCを含む下層間層を収集し、この層を新しい50ミリリットルのチューブに移します。
滅菌PBSで細胞を50ミリリットルまで懸濁し、フルブレーキで室温で10分間300 x gで遠心分離することにより、残留密度勾配培地を洗い流します。残留血小板を除去するには、原稿に記載されているように遠心分離プロセスを繰り返し、単離および精製されたPBMCを20ミリリットルのPBSに再懸濁し、標準的な方法に従って血球計算盤を使用してカウントします。CD14+単球を濃縮するには、1 x 10から7番目のPBMCを適切なポリスチレン丸底チューブに移し、細胞を300 x gで5分間ペレット化します。
上清を廃棄し、細胞ペレットを細胞分離バッファーに再懸濁した後、蓋をした状態で100マイクロリットルあたり10マイクロリットルの抗体カクテルで細胞を10分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、100マイクロリットルあたり10マイクロリットルの磁性ナノ粒子ビーズを加え、蓋をした状態で3分間インキュベートします。細胞分離バッファーで容量を2.5ミリリットルに補充します。
チューブを磁石に入れ、蓋を外した状態で3分間インキュベートします。ここで、チューブがまだ磁石内にある間に反転によって1つの連続した動きで負のセル集団を破棄します。チューブを磁石から取り外し、磁気ビーズに付着した濃縮CD14+単球を2.5ミリリットルの細胞懸濁バッファーに再懸濁して洗浄し、チューブを磁石に戻します。
前に示したように、分離されたセルをカウントします。採取した細胞を300 x gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、10%FBSを含む完全アルファ最小必須培地に1ミリリットルあたり100万細胞で細胞を再懸濁します。
破骨細胞を分化させるには、M-CSFを最終濃度25ナノグラム/ミリリットルで細胞懸濁液に添加し、十分にピペッティングして混合し、細胞懸濁液をホモジナイズします。1ウェル当たり100マイクロリットルの懸濁液を平底96ウェルプレートにプレートする。次に、培地の蒸発と培養系でのエッジ効果を防ぐために、播種した細胞の周囲にウェルあたり200マイクロリットルの滅菌蒸留水を追加します。
細胞を摂氏37度で約18〜20時間、5%の二酸化炭素で一晩インキュベートします。M-CSFおよびRANKリガンドを添加した新鮮な培地を調製します。インキュベーション後、P200ピペットを使用した吸引により培地の半分を慎重に除去し、M-CSFおよびRANKリガンドを最終濃度25ナノグラム/ミリリットルで添加した新鮮で温かい完全培地と交換します。
細胞を破骨細胞に7〜14日間分化させ、3日ごとに培地を完全に交換します。培地を除去した後、分化した付着性破骨細胞を調製した固定液のウェルあたり100マイクロリットルで固定し、1分間インキュベートします。付着細胞を傷つけないように、ウェルの底に触れないでください。
ウェルを300マイクロリットルの滅菌蒸留水で3回洗浄したら、プレートをタップして乾かし、100マイクロリットルの新たに調製した染色溶液を各ウェルに加えます。プレートを摂氏37度で暗所で20分間インキュベートします。インキュベーション後、反転によって染色溶液を除去し、プレートをウェルあたり300マイクロリットルの蒸留水で3回洗浄します。
ペーパータオルでプレートを軽くたたいて余分な水分を取り除き、プレートを開いたままにして、一晩風乾するように光から保護します。タイルオプション付きの明視野顕微鏡を使用して、10倍または20倍で画像を撮影し、井戸表面全体をキャプチャします。細胞カウンタープラグインを備えた画像解析ソフトウェアを使用して、3つ以上の核を持つTRAP+紫色染色細胞として識別された破骨細胞を手動でカウントします。
単離したCD14+単球を18ウェルチャンバー内でプレート100マイクロリットル、細胞密度1 x 10でウェル当たり5番目の細胞にスライドさせます。M-CSFおよびRANKリガンドの存在下で破骨細胞を分化させ、3日ごとに培地を完全に交換します。終了時点で、培地を静かに取り出し、pH 7.4で200マイクロリットルの予熱PBSで各ウェルを2回洗浄します。
ステップの合間にウェルを乾燥させないでください。サンプルをPBS中の4%ホルムアルデヒド溶液のウェルあたり100マイクロリットルで固定し、穏やかな振とうでオービタルシェーカーで室温で10分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞をウェルあたり200マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。
PBSで希釈した0.1%Triton x-100溶液のウェルあたり100マイクロリットルで細胞を透過処理し、前に示したように10分間インキュベートします。1ウェルあたり200マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。非特異的結合をブロックしてシグナルを増加させるには、2%ウシ血清アルブミンとPBS溶液で作った100マイクロリットルのブロッキング溶液を追加します。
穏やかな振とうしながらオービタルシェーカー上で室温で20分間インキュベートします。ブロッキング溶液を除去した後、2%BSA/PBS溶液で希釈した100マイクロリットルの蛍光結合ファロイジン溶液を各ウェルに加えます。1ウェルあたり200マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。
300ナノモルDAPIを含むPBS溶液のウェルあたり100マイクロリットルで核を染色します。10〜15分後、DAPI溶液を取り出し、ウェルあたり100マイクロリットルのPBSと交換します。適切な免疫蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、4〜40倍で染色を視覚化します。
成熟破骨細胞は、TRAP +多核細胞として定義されます。RANKリガンドの添加により、用量依存的に大きなTRAP+多核破骨細胞の数が増加しました。単球からの破骨細胞分化の速度論を2〜14日間の培養期間にわたって調べた。
多核破骨細胞は5日目以降に観察され、7日目には最適分化に達した。破骨細胞を石灰化表面上に分化させることで、丸い穴または吸収ピットの形成を分析することによってそれらの吸収活性を評価することができます。吸収の割合は、M-CSF単独と比較して、M-CSFおよびRANKリガンドの存在下で有意に増加します。
さらに、ロテノンによる処理は、未処理の対照と比較して、石灰化表面の吸収を用量依存的に阻害した。破骨細胞吸収のロテノン依存的阻害はATP産生の阻害と関連していた。成熟OCSのRANKリガンド由来アクチン環の断片化は、ロテノンの存在下で観察された。
濃縮された単球に血小板が含まれていないこと、細胞が適切な密度で播種されていること、およびエッジ効果を回避するために周囲のウェルが水で満たされていることを確認することが重要です。このプロトコルは、破骨細胞がどのように形成されるか、および基礎科学とトランスレーショナルサイエンスの両方で破骨細胞の機能に影響を与えるものを機械的に調べるのに特に役立ちます。例えば、これらのプロセスを調節することができる化合物またはタンパク質を使用することによって。
