この作業は、退役軍人省リハビリテーションR&Dサービスキャリア開発賞(CDA-1、RX002111;CDA-2;RX002928)をRSAに、MTPに功労賞(RX002615)および研究キャリアサイエンティスト賞(RX003134)、AJFにキャリア開発賞(CDA-2、RX002342)、MTPにEY028859、NEIコアグラントP30EY006360、失明を予防するための研究、および失明と戦う財団。

記載されているすべての手順は、アトランタ退役軍人省の施設動物管理および使用委員会によって承認され、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドに準拠しています(NIH出版物、第 8版、2011年更新)。
注:以下のプロトコルの開発に使用されるSD-OCTシステムは、 材料の表に記載されています。一部の手順はこの特定のシステムに固有ですが、全体的なアプローチは他のOCTデバイスや動物モデルにも適用できます。さらに、私たちの研究室では、これらのプロトコルはマウスとラットで一般的に使用されています。ただし、全体的なアプローチは、個人がデバイスに適切なレンズと機能を持っていれば、さまざまな動物モデルとSD-OCTデバイスに採用できます。
1.光干渉断層撮影装置のセットアップ
<ol><li>SD-OCT ソフトウェア(材料表)を開きます。</li>
	<li>OCT、研究、および治療群を服用している人を定義します(該当する場合)。研究者が後でデータ分析中に目的のスキャンを検索するのに役立つ方法で、これらのカテゴリに名前を付けます。<ol><li>「患者/検査」タブで、「検査官」をクリックします。試験官の名前を選択します。[検査官と医師の設定] ボタンを使用して、新しい審査官を追加します。</li>
		<li>スタディ名をクリックして、スタディを定義します。[試験]タブをクリックして、新しい試験を追加するか、既存の試験の処理を変更します。[治療群の選択]の右側をクリックして、治療群を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>[ 患者の追加 ] ボタンをクリックして、グループ全体の新しい時点を追加します。ウィンドウが表示されたら、ID番号、名、姓を入力します。[男性] または [女性] を選択します。生年月日を入力します。</li>
	<li>[ 試験の追加 ] ボタンをクリックして、個々のラットを追加します。ラットを特定するには、試験をクリックしてください。[ 試験の編集] をクリックします。[ メモの入力 ] ボックスに ID 番号を入力します。[ 変更を保存 ]ボタンをクリックします。</li>
	<li>適切なレンズをデバイスに取り付け(図1B)、ソフトウェアで対応する構成を選択し、関連する基準アームの位置をダイヤルします。 注意: 説明されているSD-OCTシステムには、画像化する動物種と目の領域(網膜または角膜、マウスまたはラット)に固有のカスタマイズされたレンズ、プリセットスキャンパターン、および 基準アーム 設定があります。これらの詳細の一部は、説明されているSD-OCTシステムに固有です(資料の表を参照)。たとえば、すべてのデバイスが 基準アーム の経路長を手動で調整できるわけではありません。</li>
	<li>[患者/検査]タブで、強調表示された検査をダブルクリックして[イメージング]タブに進み、イメージングを開始するか、[イメージング]タブをクリックします。デフォルトのスキャンがある場合は、右クリックして削除します。</li>
	<li>事前設定されたスキャンプロトコルをロードするには、[ リストからプロトコルを選択] ボタンをクリックします。または、個々のスキャンを追加します。</li>
	<li>緑内障と糖尿病性網膜症のラットモデルと網膜変性症のマウスモデルの場合、2つのODスキャンと2つのOSスキャンの4つの画像で構成されるプリセットを選択します。マウス近視の場合は、OD4スキャンとOSスキャン4スキャンの8つの画像で構成されるプリセットを選択します。 注意: プリセットイメージングについては、セクション3で詳しく説明します。これは、各ラボがオンサイトインストール中に自分で、またはメーカーと一緒に作成するものです。</li>
</ol>2.動物を麻酔する
<ol><li>麻酔薬を投与します。<ol><li>ラットにケタミン(60 mg / kg)とキシラジン(7.5 mg / kg)を腹腔内注射で麻酔します。.</li>
		<li>腹腔内注射により、ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(16 mg / kg)でマウスを麻酔します。.</li>
		<li>動物が完全に麻酔され、つま先のつまみに反応しなくなるまで待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>瞳孔拡張滴(1%トロピカミド)を投与する。画像を作成する前に、瞳孔が拡張するのを待ちます。 注:瞳孔の拡張は視野を広げますが、必須ではありません。何かが目に触れる場合(例えば、コンタクトレンズを適用する場合、またはガイドを使用する場合)、目を麻痺させるための局所(角膜)麻酔薬(0.5%テトラカイン)も使用する必要があります。ガイドは、スキャンヘッドの上に配置され、初心者が目とスキャンヘッドを並べるのに役立つデバイスです。</li>
	<li>げっ歯類に麻酔をかけた後、動物を3次元空間で回転させることができるげっ歯類の位置合わせシステムに配置します(図1A、1C、および1D)。熱サポートを提供します。 注:現在、SD-OCTデバイスで設計および販売されているマウスとラット用のげっ歯類アライメントシステムを使用しています。</li>
	<li>液体(生理食塩水や人工涙液など)を塗布して、目を滑らかに保ちます。スキャン間で目の光学特性が維持されるように、イメージング中に目が乾かないようにしてください(角膜が濡れている場合、網膜がはっきりと見えます)。<ol><li>最初の目をスキャンするときは、乾かないように反対側の目の湿気を維持してください。</li>
	</ol></li>
	<li>目の潤滑剤が多すぎたり少なすぎたりすると画質に影響するため、繊細なタスクワイプを使用して、イメージングの直前に余分な生理食塩水を吸い取ります。 注: 滅菌潤滑剤ゲルの使用は、イメージングを妨げる可能性があるため、OCT中はお勧めしません。必要に応じて、手順の後に滅菌潤滑剤ゲルを使用することができます。コンタクトレンズを適用して、テスト全体を通して目に十分な水分を確保することもできます。私たちの経験では、コンタクトレンズは画質に顕著な改善をもたらしませんでしたが、コンタクトレンズはイメージングセッション中の角膜乾燥のリスクを減らすのに役立ちます。</li>
</ol>3.げっ歯類OCTイメージング
<ol><li>片方の目(OSまたはOD)から始めて、反対側の目を後に画像化します。<ol><li>げっ歯類アライメントシステムの2つの回転運動を使用して、視線が水平になり、OCTレンズの軸を見下ろすように動物を配置します(図1D)。</li>
		<li>OCT をフリー ラン モードで使用して、データ収集のために網膜の向きを設定します。最初に照 準 モード( 照準 ボタンをクリックして)を使用すると、水平方向と垂直方向の両方のB-スキャンをリアルタイムで連続的に表示できます。</li>
		<li>網膜が見えるまでスキャンヘッドを目に近づけます(マウスとラットの網膜レンズは固定焦点であるため、レンズを目の焦点に向かって動かすと、網膜の奥深くに焦点が合います)。次に、げっ歯類の位置合わせシステムを使用して、動物の位置を上下に調整し、回転/ねじって視神経頭を中央に配置し、水平スキャンを水平にし、垂直スキャンを垂直にします(図1A)。</li>
		<li>網膜像が平らで湾曲しないように作動距離を調整します。</li>
		<li>基準アームの位置を調整して、画像を表示ウィンドウの上部近くに保ちます。押し込みすぎると、目の画像が反転しないように注意してください。</li>
	</ol></li>
	<li>網膜イメージング<ol><li>緑内障、網膜変性症、および糖尿病性網膜症モデルの場合: 平均化のために、1000 x 100 x 1 (A スキャン x B スキャン x 繰り返し B スキャン) で構成されるボリューム スキャンを定義します。ラットでは、3 x 3 mmのボリュームスキャンを行います。マウスでは、1.5 x 1.5 mmのボリュームスキャンを行います。</li>
		<li>ボリュームスキャンが中央になるように、視神経を水平方向と垂直方向のアクセスの中央に配置します。視神経乳頭がスキャンの中心にあり、鼻側頭軸と上軸と下軸に沿ってまっすぐになっていることを確認します(図2)。必要に応じて、スキャンして再センタリングし、正確に中央にあることを確認します。視神経乳頭が中央に配置され、両方の軸に沿って整列するまで、必要に応じてこのスキャンを繰り返します。[ スナップショット ]ボタンをクリックして写真を撮ります。 注意: 一部のSD-OCTデバイスには、 基準アームで光源から目の距離を調整することにより、目の湾曲を光学的に操作するオプションがあります(たとえば、画像は平らになります)。網膜層を直接厚さ測定する場合は、前後方向に沿った精度を向上させるために、画像を平坦化して中央に配置することをお勧めします。</li>
		<li>[ 保存 ]ボタンをクリックして画像を保存します。</li>
		<li>視神経乳頭を中心とした1000 x 4 x 20の放射状スキャンを行います(A-スキャン x B-スキャン x 繰り返しB-スキャン)。繰り返しBスキャンを使用して、目または網膜の画像の鮮明さを高め、データ分析中に目の領域または網膜の層を解釈するのに役立ちます。 注:繰り返しになりますが、ラットではこの放射状スキャンは3 mmですが、マウスでは放射状スキャンは1.5 mmです。</li>
		<li>画像を保存します。</li>
		<li>反対側の目で手順3.1から3.2.5を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>軸方向の長さ測定<ol><li>マウス近視など、目全体を画像化するプロジェクトでは、目全体を 3 回スキャンし、各目に対して 1 回の網膜スキャンを行います。500 x 20 x 1で、目の直径全体を網羅する放射状スキャンで構成されるプリセットを選択します。 注意: この設定は、角膜から脈絡膜までのマウスの目の全長の画像を提供します。</li>
		<li>目の中央と網膜を視野の中央に配置します。3つの放射状スキャン(全眼スキャン)を行います:1000 x 5 x 2のリニアBスキャンと、同じ場所で1000 x 5 x 2の2つの追加のリニアBスキャン。画像を保存します。</li>
		<li>その後、必要に応じてズームインし、1000 x 20 Aスキャンx Bスキャンで構成される3.2の説明と同様のボリュームまたは長方形のスキャン(網膜スキャン)を実行します。ボリュームスキャンを保存します。</li>
		<li>反対側の目で手順3.3から3.3.3を繰り返します。 注:現在のシステムのイメージングウィンドウは大きな目をキャプチャするのに十分な大きさではないため、軸方向の長さの測定は小さな目(マウスまたはそれより小さい)でのみ可能です。</li>
	</ol></li>
</ol>4.イメージング後のステップ
<ol><li>保存したデータをクラウドに保存することは、データ管理の優れたプラクティスであり、後で分析するために簡単にアクセスできます。数学的モデリングプログラム(材料表)で開発されたカスタムソフトウェアを使用してデータ分析を実行します。</li>
	<li>げっ歯類の位置合わせシステムからげっ歯類を取り除き、アチパメゾール(ラットとマウスの場合は1 mg / kg)を腹腔内注射してキシラジンの効果を逆転させ、げっ歯類がより早く目覚めるようにします。.</li>
	<li>げっ歯類が弱火で加熱パッドで回復するのを待ちます。必要に応じて追加の生理食塩水滴を与えます。げっ歯類が完全に歩行を取り戻したら、家のケージに戻します。</li>
	<li>プログラムを終了し、OCT をオフにします。</li>
</ol>5. OCT画像の後処理
<ol><li>特定のOCTニーズに合わせて数学的モデリングプログラムで開発されたカスタムソフトウェアを使用して画像を処理します(たとえば、画像を手動でマークして関心領域の厚さを測定します)。</li>
	<li>画像の目的(マウス網膜、ラット網膜、または近視/軸長)に応じて、次の3つの異なるプログラムのいずれかを使用します。<ol><li>網膜を処理するには、ロードするOCTスキャンを選択します。まず、簡単なクリックで視神経乳頭の中心を定義します。</li>
		<li>プログラムが視神経乳頭の両側の距離を定義する垂直線を生成するのを見てください。ラット網膜では、これらの線は視神経乳頭の中心から0.5 mmと1.2 mm離れており、現在分析されている橈骨Bスキャンに応じて、眼の鼻側頭軸と下上軸を表す合計4本の垂直線があります。 注意: マウスの網膜では、これらの垂直線は視神経乳頭の中心から0.25mmと0.5mmにあります。</li>
		<li>各線に沿って次のレイヤーを描画します。 網膜神経線維層(RNFL)、内網状層(IPL)、内顆粒層(INL)、外網状層(OPL)、外顆粒層(ONL)、外限界膜(ELM)、内部/外部(IS/OS)、網膜色素上皮(RPE)、および総網膜厚さ。 注意: 放射状スキャンには、通常、開いたときに鼻/側頭および上/下ラベルがありません。スキャンは、n/tおよびs/Iの向きになるように作成でき、特にこれらのスキャンは後で分析されます。</li>
		<li>画像が描かれ、プログラムが終了したら、これらの測定値をデータ分析用のスプレッドシートソフトウェアにエクスポートします。</li>
	</ol></li>
	<li>手順 5 のこれらの長さと厚さの値を使用して、地域差 (n/t/s/i) や縦方向の変化があるかどうかなど、グループ間の比較を行います。</li>
	<li>網膜測定の場合、まず、0.5 mmと1.2 mmの距離で鼻側頭軸と下上軸に違いがあるかどうかを判断します。 注意: 象限に違いが見られない場合は、0.5mmと1.2mmの測定値を一緒に平均することができます。これは、0.25 mmと0.5 mmでのみマウスの網膜スキャンを行う場合と同様のアプローチです。</li>
	<li>近視の研究では、このプログラムを使用して、目の光軸に沿った眼のパラメータを評価します。数理モデリングプログラムを開きます。まず、読み込む画像を選択します。<ol><li>画像を読み込んだ後、各スキャン(放射状およびBスキャン)を手動でマークします。角膜、水晶体、硝子体房、網膜の前縁と後端をマークして、プログラムが角膜の厚さ、レンズの厚さ、前房と硝子体の深さ、網膜の厚さ、総軸長を計算するようにします。</li>
		<li>マーキング後、保存メニューを表示するプログラムを終了します。描写された値をスプレッドシートソフトウェアに保存し、3つの別々のスキャンを一緒に平均します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+imaging+of+the+tree+shrew+eye:+Wavefront+analysis+and+retinal+imaging+with+correlative+histology.">Noninvasive imaging of the tree shrew eye: Wavefront analysis and retinal imaging with correlative histology.</a> Experimental Eye Research. 185, 107683 (2019).</li><li>Dominik Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+functional+and+structural+characterization+of+a+macular+lesion+in+a+rhesus+macaque.">Detailed functional and structural characterization of a macular lesion in a rhesus macaque.</a> Documenta Ophthalmologica. 125 (3), 179-194 (2012).</li><li>Hagag, A. M., Gao, S. S., Jia, Y., Huang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+angiography:+Technical+principles+and+clinical+applications+in+ophthalmology.">Optical coherence tomography angiography: Technical principles and clinical applications in ophthalmology.</a> Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (3), 115-129 (2017).</li><li>Treister, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Subclinical+CNV+and+Choriocapillaris+Nonperfusion+in+Fellow+Eyes+of+Unilateral+Exudative+AMD+on+OCT+Angiography.">Prevalence of Subclinical CNV and Choriocapillaris Nonperfusion in Fellow Eyes of Unilateral Exudative AMD on OCT Angiography.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 7 (5), 19 (2018).</li></ol>

著者は開示するものは何もありません。

in vivoでの眼構造の高解像度イメージングにより、経時的な網膜および眼の変化の評価が可能になります。このプロトコルでは、SD-OCTは、網膜変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、および近視のモデルでin vivoで眼構造の違いを捉えることが実証されました。
SD-OCTを実行する際の最も重要な側面は、網膜または他の関心のある眼構造の鮮明な画像を取得することです。網膜が...

スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)は、臨床医や研究者が眼の構造を非侵襲的に検査できるようにする、正確で高解像度のイメージングモダリティです。このイメージング技術は、マイクロメートルスケールでin vivoで3次元網膜画像をキャプチャする干渉法に基づいています1,2。これは、網膜層や網膜下液の構造的欠陥や菲薄化などの病理学的特徴を簡単に検出して精度が高いため、視力研究や診療所で最も頻繁に使用されるイメージングモダリティの1つになっています3。SD-OCTは、視覚関連疾患の動物モデルを用いた研究において、構造と機能の関係とその病理組織学的起源に関する重要な非侵襲的解析を提供してきました4。SD-OCTは、その解像度(眼の深さに応じて最大2〜3ミクロン)により5、網膜層の厚さのわずかな変化も検出できます。このタイプの分析は、疾患の進行に不可欠な情報を提供し、視覚関連障害に対する神経保護法と治療の有効性を評価することができます。
SD-OCTは、組織学的に構造を調べるための非侵襲的な代替手段であり、2つは相関していることが示されています6。SD-OCTは細胞分解能に達しませんが、動物での縦断的研究を可能にします。これは、特定の時点で動物を安楽死させる必要とは対照的に、個々の動物で時間の経過とともに病気の進行を追跡できるため、有利です。イメージング技術が進歩し続けるにつれて、SD-OCT技術も進歩し、画質が向上し、網膜血管機能などの生物学的プロセスを詳細に評価できるようになります。1991年の登場以来、SD-OCTテクノロジーは解像度、速度、感度が大幅に向上しています7。
本研究では、SD-OCTシステムを利用して、網膜変性、緑内障、糖尿病性網膜症のげっ歯類モデルにおける網膜層の変化を定量化します。ここで使用するSD-OCTシステムは、低電力の近赤外光を利用して深度分解画像をリアルタイムで取得、処理、保存するフーリエ領域OCTシステムです。SD-OCTシステムは、800nmの波長帯域で拡張された深度イメージング機能を備えており、8mmの深さと4μmの解像度を提供します。フーリエ領域検出では、組織からの散乱光と基準経路との間の干渉信号がフーリエ変換され、散乱強度8の軸方向スキャンおよび/または軸方向深さプロファイルが構築されます。ここでの研究では、OCTビームを目的の網膜構造上でスキャンし、軸方向スキャンを連続的に取得します。通常、スキャンパターンは、ラスタースキャンパターンを使用して2D断面画像に対応する線形1次元スキャンライン(A-スキャン)の集合として2次元グリッド(B-スキャン)を取得します。マウスの近視に焦点を当てた研究では、このシステムは眼の構造の寸法(角膜の厚さ、レンズの厚さ、硝子体の深さ、軸方向の長さなど)の測定にも使用されます。
現在のシステムでは、ユーザーは独自のプロトコルを設計し、関心のある眼の構造に基づいて調整および選択できるスキャンを作成できます。これらのユーザー定義プロトコルに搭載されている主要なスキャンにより、このイメージング技術はユーザーフレンドリーになります。画像解析のために、我々は数学モデリングプログラムでカスタマイズされたプログラミングを開発しました。SD-OCTは、眼の構造における病理学的形態学的変化を非侵襲的に特定および定量化し、視覚関連疾患の進行を監視するための強力なツールです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% tropicamide</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td>Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5% tetracaine</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0065-0741-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIM-RAS G3 120 V</td>
			<td>Leica Bioptigen</td>
			<td>90-AIMRAS-G3-120</td>
			<td>Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celluvisc gel</td>
			<td>REFRESH CELLUVISC</td>
			<td>#4554; NDC-0023-4554-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G3 18 mm Telecentric Lens</td>
			<td>Leica Bioptigen</td>
			<td>90-BORE-G3-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G3 Mouse Lens</td>
			<td>Leica Bioptigen</td>
			<td>90-BORE-G3-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G3 Rat Lens</td>
			<td>Leica Bioptigen</td>
			<td>90-BORE-G3-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heating pad</td>
			<td>Fabrication</td>
			<td>11-1130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InVivoVue software</td>
			<td>Leica Bioptigen</td>
			<td></td>
			<td>Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>mathematical modeling program</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse/Rat Kit</td>
			<td>Leica Bioptigen</td>
			<td>90-KIT-M/R</td>
			<td>Mouse/rat rodent alignment system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline</td>
			<td>ADDIPAK</td>
			<td>200-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System Envisu R4300 VHR 120 V</td>
			<td>Leica Bioptigen</td>
			<td>90-R4300-V1-120</td>
			<td>SD-OCT system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography

スペクトル領域光干渉断層撮影法(SD-OCT)は、生体内の網膜および眼の構造を視覚化するのに有用である。 研究において、SD-OCTは、さまざまな網膜および眼の疾患および損傷モデルの変化を評価および特徴付けるための貴重なツールです。光誘発網膜変性モデルでは、SD-OCTを使用して、感光体層の経時的な薄層化を追跡できます。緑内障モデルでは、SD-OCTを使用して、網膜神経線維層の減少と網膜総厚さを監視し、高眼圧症を誘発した後の視神経カッピングを観察することができます。糖尿病性げっ歯類において、SD-OCTは、研究者が網膜の総厚さの減少と、特定の網膜層、特に疾患の進行に伴う網膜神経線維層の厚さの減少を観察するのに役立ちました。近視のマウスモデルでは、SD-OCTを使用して、軸方向の長さの変化などの軸方向パラメータを評価できます。SD-OCTの利点には、眼の構造のin vivoイメージング、経時的な眼の寸法の変化を定量的に追跡する能力、およびその高速スキャン速度と高解像度が含まれます。本稿では、SD-OCTの手法を詳述し、網膜変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルにおけるSD-OCTの使用例を示す。方法には、麻酔、SD-OCTイメージング、および厚さ測定のための画像の処理が含まれます。

SD-OCTは、眼の寸法を確実に測定できるように高品質の画像が得られれば成功と見なされます。ここでは、網膜変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルを使用して、SD-OCTのさまざまな使用法を示しています。
光誘発網膜変性(LIRD)モデルでは、明るい光(10,000ルクス)への曝露は、網膜9の視細胞変性を誘導する。代表的なSD-OCT画像は、損傷を受けて?...

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In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

ここでは、スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)を用いて、網膜変性、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルにおいて、in vivoで網膜および眼の構造を可視化する方法について説明します。

光コヒーレンストモグラフィーを用いたげっ歯類モデルにおける眼疾患のin vivo構造評価

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable ...

in-vivo-structural-assessments-ocular-disease-rodent-models-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

2.8K ビュー.  Atlanta Veterans Affairs Medical Center. ここでは、スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)を用いて、網膜変性、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルにおいて、in vivoで網膜および眼の構造を可視化する方法について説明します。

ビデオ: In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

細胞融合の検出のためのCre - LOX Pの組換えのアプローチインビボでの</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.

Surgical stages of bladder augmentation are described using 3-D scaffolds in murine and rat models. To test the efficacy of biomaterial configurations for use in bladder augmentation, techniques for both awake and anesthetized cystometry are presented.

各種齧歯類モデルで内圧分析を用いた膀胱補強のためのバイオマテリアルの評価

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

統合された光音響眼底検査とスペクトラルドメイン光コヒーレンストモグラフィー

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

A detailed understanding of the complexity and relative variability within the human cardiac venous system is crucial for the development of cardiac devices that require access to these vessels. For example, cardiac venous anatomy is known to be one of the key limitations for the proper delivery of cardiac resynchronization therapy (CRT)1 Therefore, the development of a database of anatomical parameters for human cardiac venous systems can aid in the design of CRT delivery devices to overcome such a limitation. In this research project, the anatomical parameters were obtained from 3D reconstructions of the venous system using contrast-computed tomography (CT) imaging and modeling software (Materialise, Leuven, Belgium). The following parameters were assessed for each vein: arc length, tortuousity, branching angle, distance to the coronary sinus ostium, and vessel diameter.
	CRT is a potential treatment for patients with electromechanical dyssynchrony. Approximately 10-20% of heart failure patients may benefit from CRT2. Electromechanical dyssynchrony implies that parts of the myocardium activate and contract earlier or later than the normal conduction pathway of the heart. In CRT, dyssynchronous areas of the myocardium are treated with electrical stimulation. CRT pacing typically involves pacing leads that stimulate the right atrium (RA), right ventricle (RV), and left ventricle (LV) to produce more resynchronized rhythms. The LV lead is typically implanted within a cardiac vein, with the aim to overlay it within the site of latest myocardial activation. 
	We believe that the models obtained and the analyses thereof will promote the anatomical education for patients, students, clinicians, and medical device designers. The methodologies employed here can also be utilized to study other anatomical features of our human heart specimens, such as the coronary arteries. To further encourage the educational value of this research, we have shared the venous models on our free access website: <a href="http://www.vhlab.umn.edu/atlas" target="_blank">www.vhlab.umn.edu/atlas</a>.

The objective of this research is to recreate and then access the anatomy of the human cardiac venous system using 3D reconstructions generated from contrast-computed tomography scans.

灌流固定標本のコントラストコンピュータ断層撮影を用いた人間の心臓静脈系の解剖学的再建

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big challenge with the state-of-the-art retinal imaging modalities because they would require z-stacking to compile a volumetric dataset. Newer optical coherence tomography (OCT) and OCT angiography (OCTA) systems overcome these restrictions to provide three-dimensional (3D) anatomical and vascular images, but the dye-free nature of OCT cannot visualize leakage indicative of vascular dysfunction. This protocol describes a novel oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO) technique that provides 3D volumetric fluorescence retinal imaging. The setup of the imaging system generates the oblique scanning by a dove tail slider and aligns the final imaging system at an angle to detect fluorescent cross-sectional images. The system uses the laser scanning method, and therefore, allows an easy incorporation of OCT as a complementary volumetric structural imaging modality. In vivo imaging on rat retina is demonstrated here. Fluorescein solution is intravenously injected to produce volumetric fluorescein angiography (vFA).

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Here, we present a protocol to get a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence and OCT retinal image by using a novel imaging multimodal platform. We will introduce the system setup, the method of alignment, and the operational protocols. In vivo imaging will be demonstrated, and representative results will be provided.

斜め走査レーザー眼底 (オスロ) と光干渉断層計 (OCT) によるマルチモーダルインタ体積網膜イメージング

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

光干渉断層計を用いた分解足場ベース組織設計血容器開発の非破壊モニタリング

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...