このプロトコルは、血管損傷のメカニズムとその後の浮腫の発症を非侵襲的に調査するためのモデルを提供します。このテクニックの主な利点は、外科的介入なしに時間の経過とともに怪我をライブで追跡できることです。これにより、治療をより効率的にテストする手段が提供されます。
適切な尾静脈を実行し、プラットフォームに動物を正しく収容する方法を学ぶのは難しい場合があります。どちらのテクニックでも、辛抱強くゆっくりと物事を進めることをお勧めします。まず、光ファイバーケーブルをそっと扱い、レーザーコントロールボックスと網膜イメージング顕微鏡のレーザーアダプターに接続してから、網膜イメージング顕微鏡ランプボックスの電源を入れます。
コンピュータの電源を入れ、イメージングプログラムを開きます。顕微鏡の接眼レンズの前に白い紙を置き、イメージングプログラムの[調整]をクリックしてホワイトバランスを調整します。キーを回し、レーザーコントロールボックスの画面の指示に従って、レーザーコントロールボックスの電源を入れます。
ベースラインレーザー出力を確認するには、レーザーコントロールボックスを50ミリワットと2, 000ミリ秒に設定します。次に、レーザーをオンにして、パワーメーターを接眼レンズの前に置きます。フットスイッチペダルを押してレーザーをアクティブにし、レーザー出力の読み取り値が13〜15ミリワットになるようにします。
次に、レーザーコントロールボックス画面を使用して、実験用レーザー出力を100ミリワットと1, 000ミリ秒に調整し、レーザーをオフにします。500ミリリットルのビーカーに300ミリリットルの水を注ぎ、電子レンジでビーカーを1分間温めます。それからガーゼを温水に入れます。
次に、生後2ヶ月のオスのマウスを拘束具に入れます。温かいガーゼをマウスの尾にそっと押し込み、拡張した静脈を探します。26ゲージの針を使用して、動物の体重に応じて適量のローズベンガルを注入し、注射部位に圧力を加えて血腫や出血を防ぎ、部位を拭きます。
次に、マウスを拘束装置から離し、ケージに戻します。麻酔薬を注射する前に、ローズベンガルが循環するまで8分間待ちます。加熱されたマウスプラットフォームの電源を入れます。
次に、マウスの各目にフェニレフリンとトロピカミドを1滴加えます。麻酔を確認したら、塩酸プロパラカインを1眼につき1滴加え、両眼に眼軟膏を塗ります。次に、150マイクロリットルのカルプロフェンを耳の間に皮下注射します。
次に、マウスをプラットフォームに合わせ、網膜眼底のビューが明確で焦点が合うまでプラットフォームを調整します。網膜静脈を数え、眼底の画像を撮ります。次に、レーザーをオンにして、視神経乳頭から約375マイクロメートルの網膜静脈に向けます。
フットスイッチを押し、レーザービームを100マイクロメートルまでわずかに動かして血管に照射します。この手順を3回繰り返し、照射が1つのスポットに集中しないように、各パルスの後にレーザービームを移動します。他の主要な血管に照射を繰り返して、2〜3回の閉塞を達成します。
血管に照射した後、ランプを消して10分間待ちます。次に、ランプをオンに戻し、閉塞した静脈の数を数え、眼底の画像を撮ります。画像取得と生理食塩水注入の後、潤滑剤点眼薬とゲル軟膏を両眼に加えます。
マウスが麻酔から回復するのを見て、完全に回復したときにのみ他の動物と一緒にケージに戻します。レーザー照射直後に達成された閉塞の数は、ローズベンガル投与の10分後および20分後にレーザー照射された動物間で異ならなかった。網膜静脈閉塞後1日まで持続する閉塞の数は、遺伝子型とは無関係にローズベンガル投与の20分後にレーザー照射された動物で有意に減少しました。.
100ミリワットの実験パワーを変更せずに、11.5ミリワットの低いベースラインレーザーパワーはオクルージョンをもたらさなかった。対照的に、13.5ミリワットのベースラインレーザー出力は、オクルージョンに成功しました。レーザー光凝固後に起こる閉塞の主なタイプは、完全に閉塞した血管、部分的に閉塞した血管、部分的に再灌流された血管、および完全に再灌流された血管の4つです。
タモキシフェン誘導性内皮細胞Casp9ノックアウトマウスの照射血管系は、完全に閉塞した状態でより多くの時間を費やしたC57 Black 6マウスよりも、部分的に再灌流された状態および部分的に閉塞した状態でより多くの時間を費やしました。血管の閉塞状態は、レーザー光凝固後10分以内に急速に変化し、損傷後24時間で炎状の出血が観察されます。網膜静脈閉塞後に異なる眼科病理が発生した。
網膜静脈閉塞後の網膜浮腫のレベルは、光干渉断層撮影画像を使用して損傷した眼で定量化できます。ニューロン層の状態は、網膜内層の混乱を評価することによっても決定することができる。各層に対応するラベルを有する光干渉断層撮影画像の例をここに示す。
ベースラインレーザー出力の測定は重要です。この読み出しはオクルージョンの成功に大きく影響し、最適化することができます。OCT、ERG、オプタイガーなどの追加のメソッドを実行できます。
これは、網膜のニューロンの完全性と視覚経路機能に対する神経血管損傷の影響に対処するのに役立ちます。この技術は、神経血管疾患を引き起こす分子経路を調べる道を開き、個々の動物を経時的に追跡することにより、より容易にヒトの疾患に変換できるデータを提供します。
