通过甲基异硫清除和三D成像探索脂肪组织结构

这些协议允许分析非常大的人类在小鼠脂肪组织芭蕾显微镜上的三维结构。促进病理功能障碍与脂肪组织结构变化的联系。与其他明确的协议相比，这种清除过程非常简单，非常适用于在温暖的小鼠脂肪组织中清除人类，并使用毒性较低的溶剂，如乙醇或甲基水杨酸盐。

首先将收获的小鼠或人类白色脂肪组织浸入PBS中至少10毫升4%的功率甲醛中，在化学罩下优先地将15毫升的塑料管浸在PBS中。在室温下摇动卷板上的组织一小时，然后将管子在四摄氏度下将管子转移到滚动板上过夜。第二天早上，在室温下将固定的白色脂肪组织冲洗在10毫升PBS中5分钟，去除所有固定剂的痕迹，将组织转移到PBS中含有10毫升0.3%甘氨酸的15毫升管中，在室温下以每分钟100转的速度在室温下孵育1小时。

当剩余的自由醛组被淬火后，将组织浸入含有10毫升0.2%Triton X-100的15毫升管中，在37摄氏度下摇晃两小时。在孵化结束时，用10毫升0.2%Triton X-100和20%DMSO治疗组织，在37摄氏度下一夜之间摇晃。第二天早上，将组织浸入含有10毫升0.1%Tween 20、0.1%Triton X-100、0.1%脱氧二甘酸酯和20%DMSO的15毫升塑料管中，在37摄氏度下至少孵育24小时，并摇动。

在孵化结束时，在轨道摇床上以每分钟100转100转的速度用10毫升0.2%Triton X-100的PBS冲洗组织，一小时。随后在 37 摄氏度下浸入 15 毫升 0.2%Triton X-100、10% DMSO 和 3%BSA 中 12 小时，在 37 摄氏度下摇晃。用于染色白色脂肪组织。

将组织转移到 PBS 中 0.2%Triton X-100、10%DMSO 和 3%BSA 的 300 微升中，辅以 1.5 毫升微管中感兴趣的主要抗体，用铝箔保护其免受光线的感染，将管放入 50 毫升猎鹰管中。将管子放入轨道摇床中，在37摄氏度的高温下孵育两天。在孵化结束时，在0.2%Triton X-100、10%DMSO和3%BSA的10毫升中，在PBS中冲洗组织两次，在37摄氏度下冲洗5小时，并防震防光。

第二次冲洗后，用10毫升新鲜0.2%Triton X-100洗涤组织， 10%DMSO 和 3%BSA 和 PBS 在 37 摄氏度下进行 16 至 48 小时摇晃，然后将组织转移到含有 300 微升的 1.5 毫升管中，其中含有 0.2%Triton X-100、10%DMSO 和 3%BSA，辅以适当的二级抗体，并使用铝箔保护管免受光。在摇床上37摄氏度下孵育两天后，在0.2%Triton X-100、10%DMSO和3%BSA的10毫升中清洗组织，在37摄氏度下在37摄氏度下用震动防止光线。第二次洗涤后，将组织冲洗成含有10毫升新鲜0.2%Triton X-100、10%DMSO和3%BSA的管，在37摄氏度下在37摄氏度下16至48小时。

接着是两小时在10毫升PBS中洗涤，温度为37摄氏度，有震动和光线保护。用于在PBS洗涤结束时清除的白色脂肪组织，将上升发送乙醇浓度序列的组织和10毫升浸入，在室温下每浓度孵育两小时，并如所示，震动不受光线影响。第二天早上，将组织浸入一个20毫升的玻璃瓶中，瓶盖塑料瓶中含有5毫升甲基水杨酸盐。

在这个阶段，白色脂肪组织仍然清晰可见。摇动容器，在室温下防止光线至少两小时。白色脂肪组织完全移植。

用于染色和清除白色脂肪组织的 3D 共生成像安装一个金属成像室，该成像室配有玻璃底部，并在烟罩中将组织传输到腔室。用新鲜的甲基水杨酸盐填充腔室。通过添加一个小盖滑来稳定组织和一个大盖滑来关闭腔室，完成腔室的安装。

将腔室置于倒置共生显微镜阶段，以低放大倍率进行组织成像，生成整个脂肪组织样本的几立方厘米 3D 贴图。生成 3D 地图后，使用 20 倍长距离空气目标，在分辨率和深度之间提供良好的比，以更高的放大率选择多个区域进行组织采样。对于单元格分段，将 3D 堆栈转换为软件格式以释放内存空间。

打开软件的单元模块之前。将细胞检测设置更改为等离子膜染色，并选择用于描绘细胞外围标记的荧光通道。然后设置阈值，提供预期单元格大小的范围并运行分段。

用肉眼观察清除对人与小鼠白脂肪组织的影响。清除也大大提高了能够获取的组织的图像深度。便于整个组织 3D 成像和 4 倍放大的 3D 地图生成。

3D 映射还允许在 20 倍放大到 2 毫米的深度时选择不同的感兴趣区域。脂质液滴和脂肪细胞的特异性染色可分别使用佩里平和抗胶原4抗体实现。血管可以在牺牲前不久使用CD31抗体或静脉注射Lectin DyLight 649来检测。

使用抗CD301植物红素抗体和抗TCRβ太平洋蓝色抗体可以可视化巨噬细胞和T细胞。使用抗酪氨酸羟基酶抗体可检测外周神经网络。使用这些标记可以确定脂肪细胞和脂肪组织内的血管网络密度的均值和大小分布。

遵循职业时间至关重要，因为样品制备不良不会产生良好的图像质量。该协议可以与先进的成像系统相结合，也可以与后处理图像分析免费软件相结合。