Bu protokol fare yağ dokusu bale mikroskopisi üzerinde çok büyük insan üç boyutlu yapısının analizini sağlar. Patolojik disfonksiyonun yağ dokusu yapısal değişiklikleri ile bağlantısını kolaylaştırmak. Bu temizleme işlemi çok basit, çok iyi sıcak fareler yağ dokusu üzerinde insan temizleme ve diğer açık protokollere göre etanol veya metil salisilat gibi daha az toksik çözücü kullanmak adapte.
Hasat edilen fareyi veya insan beyaz yağ dokusunu pbs'de %4 güç formaldehitinin en az 10 mililitrelik bir kimyasal kaputun altında tercihen 15 mililitrelik plastik tüpe batırarak başlayın. Bir gece boyunca dört derece santigrat bir haddeleme plaka tüpü transfer etmeden önce bir saat oda sıcaklığında bir haddeleme plaka üzerinde doku sallayın. Ertesi sabah sabit beyaz yağ dokusunu oda sıcaklığında 10 mililitre pBS'de beş dakika boyunca durulayın ve sabitleme nin tüm izlerini ortadan kaldırın ve dokuyu PBS'de 10 mililitrelik glisin içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dakikada 100 devirde bir orbital shaker'da oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için.
Kalan serbest aldehit grupları söndürüldüğünde, 37 santigrat derecede sallayarak iki saat kuluçka için PBS 0,2% Triton X-100 10 mililitre içeren 15 mililitrelik bir tüp doku batırın. Kuluçka sonunda bir gecede 37 derece santigrat sallayarak 0.2% Triton X-100 ve% 20 DMSO 10 mililitre ile doku tedavi. Ertesi sabah 15 mililitrelik plastik tüp içeren bir doku batırın 10 mililitre 0.1% Tween 20, 0.1% Triton X-100, 0.1% deoksicholate ve 20% DMSO PBS en az 24 saat kuluçka için 37 derece santigrat ile sallayarak.
Kuluçka sonunda, bir saat boyunca dakikada 100 devrimler bir orbital shaker bir orbital shaker pbs 0,2% Triton X-100 10 mililitre ile doku durulayın. 15 mililitre de daldırma takip 0.2%Triton X-100, 10% DMSO ve 3% BSA PBS 12 saat boyunca 37 derece santigrat titreme ile. Beyaz yağ dokusunun boyanmak için.
Doku transferi içine 300 mikrolitre içine 0.2%Triton X-100, 10% DMSO ve PBS% 3 BSA, bir 1.5 mililitremikro tüp ilgi birincil antikorları ile takviye alüminyum folyo ile ışık tan korumak ve 50 mililitrelik şahin tüp içine tüp yerleştirin. Sallayarak 37 santigrat derece iki günlük kuluçka için orbital shaker içine tüp yerleştirin. Kuluçka sonunda doku yutuculuk ile 10 mililitre de iki kez durulayın 0.2%Triton X-100, 10%DMSO ve PBS 3% BSA beş saat boyunca 37 derece santigrat sallayarak ve ışıktan koruma ile.
İkinci durulama sonra taze 10 mililitre doku yıkayın sonra 0.2%Triton X-100, 10% DMSO ve 3% BSA ve PBS 16 ila 48 saat için 37 derece santigrat titreme ile, daha sonra 0.2% Triton X-100 300 mikrolitre içeren 1.5 mililitre tüp doku transferi, 10%DMSO ve PBS% 3 BSA, uygun ikincil antikorlar ile takviye ve alüminyum folyo kullanarak ışık tan tüp korumak. Bir shaker üzerinde 37 derece santigrat bir iki gün kuluçka sonra, ışıktan korunan sallayarak sallayarak 37 santigrat beş saat boyunca PBS% 0.2 Triton X-100, % 10 DMSO ve 3% BSA 10 mililitre doku iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, sallayarak ve ışık koruması ile 37 santigrat derecede 16 ila 48 saat pbs taze% 0.2 Triton X-100, 10% DMSO ve 3% BSA 10 mililitre içeren bir tüp içine doku durulayın.
Sallayarak ve ışık koruması ile 37 santigrat derece tek başına PBS 10 mililitre iki saat yıkama izledi. PBS sonunda beyaz yağ dokusu temizleme için doku ve artan bir etanol konsantrasyonu serisi 10 mililitre oda sıcaklığında konsantrasyon başına iki saat kuluçka için ışıktan korunan titreme ile daldırma. Ertesi sabah bir duman kaputunda metil salisilat beş mililitre içeren plastik bir kap ile 20 mililitrelik cam şişe doku batırın.
Beyaz yağ dokusu hala açıkça bu aşamada görülebilir. Kabı oda sıcaklığında en az iki saat Boyunca ışıktan koruyun. Beyaz yağ dokusu tamamen nakil olur.
Vitray lı ve temizlenmiş beyaz yağ dokusunun 3Boyutlu konfokal görüntülemesi için, cam bir alt ve duman kaputunda bulunan metalik bir görüntüleme odası nın montajı dokuyu odaya aktarın. Odayı taze metil salisilatla doldurun. Dokuyu stabilize etmek için küçük bir kapak fişi ve odayı kapatmak için büyük bir kapak fişi ekleyerek haznenin montajını kesinleştirin.
Tüm yağ dokusu örneğinin birkaç santimetreküp 3D haritaları oluşturmak için düşük büyütme doku görüntüleme için ters bir konfokal mikroskop aşamasıüzerine oda yerleştirin. 3B harita oluşumundan sonra, daha yüksek bir büyütmede doku örneklemesi için çeşitli alanları seçmek için çözünürlük ve derinlik arasında iyi bir oran sağlayan 20X uzun mesafe hava hedefi kullanın. Hücre bölümleme için bellek alanı boşaltmak için yazılım biçimiüzerine 3B yığınları dönüştürün.
Yazılımın hücre modüllerini açmadan önce. Hücre algılama ayarını plazma membran boyama ile değiştirin ve hücre çevresini belirlemek için kullanılan işaretçinin floresan kanalını seçin. Ardından eşikleri ayarlayın, beklenen hücre boyutları aralığını sağlayın ve segmentasyonu çalıştırın.
İnsan ve fare beyaz yağ dokusu nun temizlenmesinin etkileri çıplak gözle görülebilir. Takas aynı zamanda elde edilebilir doku görüntü derinliğini önemli ölçüde artırır. Ve tüm doku 3D görüntüleme ve 4X Büyütme dışında 3D harita üretimi kolaylaştırır.
3D haritalama, 20 X büyütme de iki milimetre derinliğe kadar farklı ilgi alanlarının seçilmesini sağlar. Lipid damlacıkları ve adipositlerin spesifik boyanması sırasıyla perilipin ve anti-GLUT4 antikorları kullanılarak elde edilebilir. Kan damarları kurban dan kısa bir süre önce CD31 antikor veya Lectin DyLight 649 intravenöz enjeksiyonu kullanılarak tespit edilebilir.
Makrofajlar ve T-hücreleri anti CD301 phycoerythrin antikor ve anti TCR beta Pasifik mavi antikor kullanılarak görselleştirilebilir. Periferik sinir ağı anti Tirozin Hidroksilaz antikor kullanılarak tespit edilebilir. Bu etiketler kullanılarak adipositlerin ortalama boyut ve boyut dağılımı ve yağ dokusu içindeki kan damarı ağ yoğunluğu daha sonra belirlenebilir.
Kötü numune hazırlama iyi bir görüntü kalitesi neden olmaz, çünkü gösterildiği gibi meslek zamanı takip etmek çok önemlidir. Bu protokol gelişmiş görüntüleme sistemi ile kombine edilebilir veya post-processing görüntü analizi freeware ile birleştirilebilir.
