이러한 프로토콜은 마우스 지방 조직 발레 현미경검사에 매우 큰 인간의 3 차원 구조의 분석을 할 수 있습니다. 지방 조직 구조 변화와 병리학 적 기능 장애의 연결을 촉진. 이 클리어링 과정은 매우 간단하며, 따뜻한 쥐에 인간을 지우는 데 매우 잘 적응되어 조직 조직을 지방 조직으로 제거하고 다른 명확한 프로토콜에 비해 에탄올 또는 메틸 살리실레이트와 같은 독성이 적은 용매를 사용합니다.
먼저 수확한 마우스 또는 인간의 백색 지방 조직을 PBS에서 4% 이상의 포름알데히드(포름알데히드)에 15밀리리터 플라스틱 튜브를 화학 후드 아래에 두는 것으로 시작합니다. 하룻밤 사이에 4도에서 튜브를 압연 플레이트로 옮기기 전에 1 시간 동안 실온에서 롤링 플레이트에 티슈를 흔들어보십시오. 다음날 아침, 고정된 백색 지방 조직을 실온에서 5분 동안 PBS10 밀리리터로 헹구고, 1000분의 궤도 셰이커에서 실온에서 10밀리리터의 글리신을 포함하는 15밀리리터 튜브로 조직을 이송한다.
나머지 무료 알데히드 그룹이 담금질되었을 때, PBS에서 0.2%의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브에 조직을 담급하여 섭씨 37도에서 흔들어 두 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션의 끝에서 0.2 %의 트리톤 X-100 및 20 %DMSO의 10 밀리리터로 조직을 치료하며 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 흔들리고 있습니다. 다음날 아침, PBS에서 0.1%Tween 20, 0.1%트리톤 X-100, 0.1%deoxycholate 및 20%DMSO를 함유한 15밀리리터 플라스틱 튜브에 조직을 몰입하여 37°C에서 최소 24시간 동안 잠복합니다.
인큐베이션이 끝나면 PBS에서 0.2%의 10밀리리터로 조직을 헹구고 분당 100회전에서 1시간 동안 궤도 셰이커를 시비탈 셰이커로 헹구는다. 그 다음으로 0.2%의 트리톤 X-100, 10%DMSO, PBS 3%BSA의 15밀리리터에 12시간 동안 37°C의 흔들림이 뒤따랐습니다. 흰색 지방 조직의 염색을 위해.
조직을 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS의 3%BSA로 전송하여 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 대한 주요 항체로 보완되어 알루미늄 호일로 빛을 보호하고 튜브를 50 밀리리터 팔콘 튜브에 넣습니다. 튜브를 궤도 셰이커에 넣고 2일 동안 흔들리는 섭씨 37도에서 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS3%BSA의 10밀리리터에서 2회 조직을 헹구고 37도에서 5시간 동안 PBS에서 37도의 흔들림과 빛으로부터 보호합니다.
두 번째 헹도 세척 후 10 밀리리터에서 10 밀리리터의 신선한 0.2% 트리톤 X-100, 10%DMSO 및 3%BSA 및 PBS는 섭씨 37도에서 16~48시간 동안 0.2%트리톤 X-100, 10%DMSO 및 PBS의 3%BSA를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브로 이송하여 적절한 이차 항체및 알루미늄을 사용하여 알루미늄을 보호합니다. 셰이커에서 섭씨 37도에서 이틀 간 배양한 후, 0.2%의 트리톤 X-100, 10%DMSO, 3%BSA의 10밀리리터에서 2회 세척하여 37°C에서 5시간 동안 PBS에서 37도에서 진동을 방지합니다. 두 번째 세척 후, 신선한 0.2 %트리톤 X-100, 10 %DMSO 및 PBS에서 3 %BSA의 10 밀리리터를 포함하는 튜브로 조직을 헹구고 37 섭씨에서 37 섭씨에서 흔들리고 빛 보호합니다.
그 다음에는 PBS 10밀리리터에서만 37도에서 흔들림과 가벼운 보호 기능을 하며 2시간 동안 세척합니다. PBS 세척의 끝에 백색 지방 조직 클리어링을 위해, 지시된 바와 같이 빛으로부터 보호되는 흔들림과 함께 실온에서 농도당 2시간 배양에 대한 오름차순 송신 에탄올 농도 시리즈의 조직 및 10 밀리리터를 침수한다. 다음 날 아침, 연기 후드에 메틸 살리실레이트 5밀리리터가 들어있는 플라스틱 캡이 달린 20밀리리터 유리 병에 티슈를 담그면 됩니다.
백색 지방 조직은 이 단계에서 아직도 명확하게 보입니다. 용기를 흔들어 적어도 2 시간 동안 실온에서 빛으로부터 보호하십시오. 백색 지방 조직은 완전히 이식됩니다.
스테인드 및 클리어 된 흰색 지방 조직의 3D 공초점 화상 진찰을 위해 유리 바닥과 연기 후드가 장착 된 금속 이미징 챔버를 챔버로 전달합니다. 신선한 메틸 살리실레이트로 챔버를 채웁니다. 작은 커버 슬립을 추가하여 챔버의 장착을 마무리하여 조직을 안정화시키고 큰 커버 슬립을 챔버를 닫습니다.
전체 지방 조직 샘플의 몇 입방 센티미터 3D지도를 생성하기 위해 낮은 배율에서 조직 이미징을위한 반전 공초점 현미경 단계에 챔버를 배치합니다. 3D 맵 생성 후 해상도와 깊이 사이의 좋은 비율을 제공하는 20배 장거리 공기 목표를 사용하여 더 높은 배율에서 조직 샘플링을 위한 여러 영역을 선택합니다. 셀 세분화의 경우 3D 스택을 소프트웨어 형식으로 변환하여 메모리 공간을 확보합니다.
소프트웨어의 셀 모듈을 열기 전에. 세포 검출 설정을 플라즈마 멤브레인 염색으로 변경하고 세포 주변을 설명하는 데 사용되는 마커의 형광 채널을 선택합니다. 그런 다음 임계값을 설정하고 예상 셀 크기의 범위를 제공하고 분할을 실행합니다.
인간과 마우스 백색 지방 조직에 청산의 영향은 육안으로 관찰될 수 있습니다. 클리어링은 또한 획득할 수 있는 조직의 이미지 깊이를 크게 향상시킵니다. 또한 4배 배율로 조직 3D 이미징 및 3D 맵 생성을 용이하게 합니다.
3D 매핑을 통해 20배배율에서 2밀리미터 깊이로 다양한 관심 영역을 선택할 수 있습니다. 지질 방울과 지방세포의 특정 염색은 각각 페리핀 및 항글루4 항체를 사용하여 달성될 수 있다. 혈관은 희생 직전에 CD31 항체 또는 렉틴 DyLight 649의 정맥 주사를 사용하여 검출될 수 있습니다.
대식세포및T세포는 항체 CD301 피코에리스린 항체 및 항 TCR 베타 퍼시픽 블루 항체를 사용하여 시각화될 수 있다. 말초 신경 네트워크는 항 티로신 하이드록실라제 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 라벨링을 이용하여 지방 조직 내의 선포세포 및 혈관 네트워크 밀도의 평균 크기 및 크기 분포를 결정할 수 있다.
열악한 샘플 준비로 인해 좋은 이미지 품질이 발생하지 않기 때문에 작업 시간을 입증한 대로 따르는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 고급 이미징 시스템과 결합하거나 후처리 이미지 분석 프리웨어에 결합될 수 있습니다.
