X線と中性子結晶学の両方に大きく、高品質の結晶を得るための異なる結晶化アプローチがあります。これらのアプローチの1つは、透析法を用いるというものです。この技術では、タンパク質溶液は半透過性膜によって沈殿液から分離される。
沈殿分子は膜を横切ってタンパク質チャンバーに拡散する。自発的な核形成のための正しい過飽和が達成されると、最初の核が現れます。ここでは、温度制御透析結晶化を用いて開発した全自動機器であるOptiCrysが使用できるプロトコルと、結晶相図の知識に基づく天然高分子結晶学用の大きな高品質結晶を成長させるマイクロ透析ボタンを用いることを実演します。
特定のマイクロリットルの容積ピペット35マイクロリットルのリソチーム溶液を透析チャンバーに付けたマイクロ透析ボタンのため。この余分な容積は透析の部屋の上にわずかにドームの形を作成し、気泡の形成を防ぐ。アプリケーターを取り、弾性またはリングをその先端に置きます。
チャンバーの上に膜を置き、アプリケータから透析ボタンの溝に弾性またはリングを移すことによってそれを固定します。結晶化液を含むウェルにボタンを移します。ガラスカバースリップまたはテープで井戸を覆います。
振動フリーの熱調整器インキュベーターで293ケルビンでサンプルを保ちます。透析結晶化が結晶成長の観点から利点を提供することを知って、いわゆるOptiCrys結晶化ベンチは、生体分子結晶化実験の温度と化学組成の完全に自動化された組み合わせ制御を提供するために私たちの研究室で設計され、開発されました。OptiCrysによる結晶成長の最適化は、温度沈殿物濃度相図に基づいています。
核形成は、転移性領域付近の核形成ゾーンで起こり、次いで、タンパク質濃度が溶液と結晶の間の熱力学的平衡を表す溶解性曲線に達するまで、相図後の転移性領域で起こる。直接溶解性のあるタンパク質の場合には温度を下げるか、塩析が到達した場合の沈殿物濃度を上昇させることにより、結晶化溶液は、転移領域に残り、核形成は起こらない。結晶は平衡が達成するまで成長し、その後、結晶のサイズのそれ以上の増加は見られない。
温度を下げるか、沈殿物濃度を増加させる結晶が所望のサイズに達するまで数回繰り返される。セットアップされた温度制御流れの透析チャンバーにタンパク質溶液を加え、透析膜で上の部屋を覆い、弾性またはリングで膜を固定します。オーバーチャンバーを反転し、透析チャンバーの上に置きます。
2つの部分の間に閉じ込められたすべての空気を取り除くために穏やかにゆっくりと押し、上の部屋の上にそっとねじ込むことによって、その位置に貯水池を固定します。結晶化液を貯留槽に加え、気密キャップで覆います。このアセンブリを転送し、結晶化ベンチオプティクリスクリスタル成長の乳房サポートにそれを挿入結晶化ベンチOptiCrysの監督ソフトウェアです。
これには、4 つの異なるグラフィカル インターフェイスまたはビューが含まれています。ホーム ビューには、他のビューに移動するためのボタンが含まれています。セットアップ インターフェイスの目的は、テスト ビューで自動的に実行できる実験シナリオを定義することです。
最後のビューはメンテナンス ビューです。実験を再開するには、結晶化実験をスムーズに実行するための必須パラメータがすべて見つかるメンテナンスビューが開いている必要があります。光部から光度を上げると、光はゼロから、光が100の最大輝度に増加する可能性があります。
温度の制御と監視には、温度調整部が使用されます。ボタンをクリックしてオンにします。設定点セクションの温度を設定し、Enterキーを押します。
このボタンの下には、2 つのグラフがあります。赤いものは最終を示し、注文温度と黄色のグラフは現在の温度を示しています。ストック溶液を混合し、貯蔵室への結晶化溶液の注入は、Palmセクションによって制御される。
最初の段階でストック溶液の濃度を追加します。次に、各新しいグルーパー溶液の最終濃度を見つけ、最終濃度セクションに追加します。計算ボタンを押した後、ストック溶液の量を見つけると計算され、各濃度パネルの前のボリュームパネルに追加されます。
起動準備ボタンを押して、新しいプレミアソリューションの準備が整うまで待ちます。結晶化液を交換するには、溶液入力ボタンをクリックします。プロセスを停止するには、[配布の停止] ボタンを押します。
顕微鏡部の右側には、各結晶成長実験から重要な情報を記録するためのパネルが複数ある。このセクションでは、対応するタンパク質名、分子量、結晶化条件を追加します。フォルダ名に入力するだけで、実験の名前を定義します。
nb画像セクションから、実験中に撮影する画像の数を選択します。画像の番号を追加し、右側のパネルからタイマースケールを選択します。フォルダボタンをクリックしてフォルダを開きます。
このフォルダには、実験用に以前に定義したすべての情報を含むテキスト ファイルがあります。これ以上の治療の準備ができている画像もこのフォルダに保存されます。顕微鏡をズームオフすることも自動的に変更することができます。
顕微鏡セクションの上にあるプラスボタンとマイナスボタンを使用してズームを変更し、それぞれ倍率を増減します。結晶サイズを測定するには3つの異なる方法があります。長さまたは幅を測定するために幅ベクトルを使用してください。
結晶形状に応じて、顕微鏡部の左部分から特定の工具を選ぶことができます。長方形や多角形など。値は、メジャー セクションに表示されます。
実験の最初のセットでは、マイクロ透析ボタンは、異なる塩濃度の結晶化溶液に浸漬した。この単純な結晶化グリッド実験では、唯一の変数は沈殿物濃度です。温度が一定に保たれている間。
塩濃度のわずかな変動は、塩濃度を0.7から1.2モルの過飽和度上昇に増加させ、核形成ゾーン内の溶液が転移性ゾーンから遠ざかることによって結晶化相図を調べることができるようになる。その結果、結晶の数や大きさの変化が見られ、結晶の数が増え、そのサイズが小さくなります。与えられた実験条件下でのOptiCrysを用いた最初の実験では、透析チャンバー内の平衡が到達すると、結晶化溶液は結晶化相図の転移領域付近の核形成帯内にある。
その結果、実験の最初の段階で生成される核はわずかです。結晶の成長をメタスタブルゾーンに保ち、結晶成長過程を制御するために、温度は異なる時間間隔で変化した。結晶溶液平衡が完成する度に、温度を変化させた。
したがって、温度は291ケルビン、288ケルビン、そして最後に275ケルビンに低下し、メタスタブルゾーン内で選択された結晶の成長を維持した。この実験の結果は、天然の高分子結晶学に必要な体積を持つ単一の大きな結晶です。次の2つの実験は、核化、結晶成長、溶解および再成長のための温度制御透析実験の可逆性を示す。
OptiCrysを用いた2回目の実験では、結晶化溶液の化学組成を実験を通じて一定に保ち、温度を変化させた。初期温度は291ケルビンに設定されました。高過飽和のため、結晶化チャンバーに多数の小結晶が現れた。
直接タンパク質溶解性の概念に従って、温度を313ケルビンに徐々に上昇させることで全ての結晶が溶解した。最後に、温度を295ケルビンに下げることによって、2番目の核形成をメタスタブルゾーン付近で開始し、より少ない数の核形成をもたらす核形成プロセスを制御することを許した。さらに結晶成長により、より大きな結晶の均一な集団を生成することができた。
本実験では、結晶化液の化学組成を一定温度で変化させると、より大きな結晶の均一な集団を得る。結晶化条件は、前回の実験と同様であった。結晶を溶解し、NaCl濃度を0.9モルからゼロに徐々に低下させることで達成した。
塩濃度を低下させることは、結晶の溶解につながる相図の不飽和ゾーン内の溶液を維持する。次いで、以前よりも低いイオン強度を有する新しい結晶化溶液を、貯留室に注入した。この沈殿物濃度では、結晶の数が少なく、結晶が以前よりも大きな体積に達します。
ここでは、ラボで開発された完全に自動化された機器を使用して、天然の高分子結晶学用の大きくて高品質の結晶を成長させるサンプル調製と制御ソフトウェアの調整を説明する詳細なプロトコルを提供しました。このステップバイステップの手順は、核生成と結晶成長を分離するために結晶化相図の知識から設計され、利益を得た。さらに、微小細胞化パターンを持つ結晶を成長するためのプロトコルは、OptiCrysが利用できない場合の代替としてマクロサイトシスボタンを使用して提示されます。
私がOptiCrysの結晶化溶液の化学組成と温度を変更し、画像を撮るために言及した戦略に加えて、手動で行う必要があります。温度を一定に保つためにインキュベーターの熱調節振動を使用することが必要であり、これは実証された方法論の重要なステップである。
