この作品は、分子バイオテクノロジー、iBio社と米国防総省の国防高等研究計画庁（助成金＃のHDTRA1-07-C-0054）のためのフラウンホーファーアメリカセンターによってサポートされていました。著者は、博士によって寛大な贈り物を認める。生物科学専攻、パデュー大学（ アグロバクテリウムツメファシエンス株 ）、大規模バイオ株式会社（ 髄膜excelsiana種子 ）のウェイン·フィッツモーリス、ならびに米国ニコチアナ ·コレクションのジェニファー·ニコルソン、ノースカロライナ州立大学（N.エクセルシオール種子のスタントンGelvin ）。著者らは、植物や優れた技術支援を提供するためのマーガレット·シリングフォードとクリストファー船体に感謝します。著者らはまた、博士に感謝します。編集上の支援のためのスティーブン·ストレトフィールドとナターシャKushnir。

1。植物栽培その後のアグロ浸潤のために我々は2つの野生型タバコ種（N.ベンタミアナおよびN.エクセルシオール ）と室内施設でロックウールで水耕栽培ハイブリッド（ 髄膜excelsiana）を評価した。 <ol><li>植物肥料溶液中でロックウールスラブを浸す。 </li><li>野生型Nの種をまくベンサミアナ、N.エクセルシオールとN栄養素に関するexcelsiana（N.エクセルシオール×N.ベンタミアナのハイブリッド）ロックウールの表面を浸した。 </li><li>のために制御された条件（24℃、40から65パーセントの相対湿度）の下で種子から植物や（130〜150μEmの照明で14時間の明および10時間の暗闇、-2秒-1）、長日光周期を育てるNの4-5週間ベンサミアナとN excelsiana、およびNの5-6週間エクセルシオール。 </li></ol> Agroinfiltratのためのベクターの2。建設イオン<ol><li>インフルエンザウイルス（HAC1）のA/California/04/2009株から合成レポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質[GFP]）、フルレングスの赤血球凝集素（HA）を挿入し、再設計リケナーゼ酵素（LicKM）18を別々にpBID4-GFP、pBID4-HAC1とpBID4-LicKM、それぞれ18,32,41,47を取得するために打ち上げベクトルpBID4 18（TMVに基づいたベクトル）。 </li><li> Aのエレクトロ細胞内にGFPまたはHAC1を運ぶpBID4 10〜50 ngのご紹介Aのエレクトロ細胞へツメファシエンス GV3101株とLicKM ツメファシエンスは、遺伝子MicroPulserのエレクトロとGV3101、C58C1、GLA4404、AT06、AT10、At77とA4菌株。 </li><li>特に断りのない限り、浸透実験のために変換されたアグロバクテリウムを使用してください。 </li></ol> 3。 タバコ植物にアグロバクテリウムの浸潤を掃除<ol><li> A.を育てるLB培地、YEB MED IN（O / N）の株を一晩ツメファシエンスイウムまたはAB培地は、200〜250 rpmで振盪しながら28℃でカナマイシンを50mg / L添加。 </li><li> 4,000倍で又はYEB若しくはLBで増殖させたAB 0.5又は遠心アグロバクテリウム細胞の600nmの光学密度のMilli-Q水（600mL）中の希薄なアグロバクテリウム 4℃で10分間、gは0.5〜600誘導培地（1×MS塩、10mMのMES、200μMのアセトシリンゴン、2％スクロース[MMA]）に再懸濁し、1〜3を室温で撹拌人事、いない限りは、特に記載がない。 </li><li> アグロバクテリウム懸濁液中にタバコ植物の空中組織を浸すと30または60秒間50〜400ミリバールの真空を印加することにより真空チャンバ内の植物を浸潤する。最適な浸潤は、日常的に60秒間50〜100ミリバールで適用される。 </li><li>真空が破壊されると、水中ですすぎ、真空チャンバから植物を取り外し、プレ浸透成長のために使用されるのと同じ成長条件下で5-7日間増殖。 </li><li>有効性をテストするにはアグロバクテリウムのvir遺伝子は、アセトシリンゴンの異なる濃度（0、100、200または400μM）誘導化学物質の浸潤バッファー（1×MS、10mMのMES、2％グルコース）に懸濁アグロバクテリウムに添加した。のvir遺伝子は、グルコースの異なるパーセンテージ（0,1,2、または4％）の誘導に対する単糖の影響を浸潤緩衝液（1×MS、10mMのMES、200μMのアセトシリンゴン）中に懸濁アグロバクテリウムに添加した。N.ステップ3.3および3.4）で上記のようにベンサミ植物を浸透させた。 </li><li> アグロバクテリウムの研究室では、GV3101、C58C1とLBA4404菌株とpBID4-LicKMベクターを有する野生株、A4、AT06、AT10、そしてAt77は0.5の600にミリQ水で希釈した。N.ベンサミ植物は、ステップ3.3および3.4で前述したように、それぞれ特定の株を浸潤させた。 </li></ol>ウイルスサイレンサプレッサのため4。共同アグロインフィルトレーション手順<ol><li> MGFP遺伝子と1:1、2:1,3:1および4:1の比率でトマトブッシースタントウイルス （TBSV）のウイルスサイレンシングサプレッサーP19を運ぶミリQ水で薄めたアグロバクテリウム GV3101培養IX。 N.潜入上記のようにベンサミアナ植物 。 </li><li> N.潜入 2ミリQ水で薄めたアグロバクテリウム GV3101培養の混合物とベンサミアナ植物：pBID4-HAC1のプラスミドを有する第一及びサイレン抑制のいずれかを運ぶ二- TBSVのP19やシトラストリステザウイルスのP23、pCasspプラスミド中の（ pCassp19）と比4:1でそれぞれ35Sプロモーター（PGR-P23）の下でPGRバイナリープラスミド、で。 </li></ol> 5。ウエスタンブロット分析<ol><li> Nからランダム葉のサンプルを収集ベンサミアナ、N.エクセルシオールまたはN excelsianaの 4-7 dpiで植物や微粉末に液体窒素中で粉砕。 </li><li> 0.5％のトリトンを含有する1×PBS緩衝液の3つのボリュームの追​​加X-100を各サンプルに。 </li><li>静かに4℃で15分間抽出したサンプルを振る</li><li> 5分間の抽出物をスピンし、清潔なエッペンドルフチュー​​ブに全可溶性タンパク質を収集します。 </li><li> 1×PBS抽出緩衝液中で適当に希釈した（1:50〜1:100）に抽出物を希釈し、5×試料緩衝液（250mMのトリス-HCl [pHを6.8]、10％SDS、0.5％ブロモフェノールブルー、50％グリセロールを追加最終1×濃度にV / V、および500のDTT）。 </li><li> 5分間沸騰サンプル。 </li><li> 10％SDS-PAGEによってタンパク質を分離するには、イモビロン-Pトランスファーメンブレンに転写し、0.5％I-ブロックにブロックする。 </li><li> 1時間ブロッキング溶液で1:1000に、マウス抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を用いて1:5,000およびHAC1でウサギポリクローナル抗GFP抗血清を用いてGFPを検出する。 </li><li>一次抗体標識後、1×PBST-20で膜を10分間各3回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼと共にインキュベート（HRP） - 結合1:5000の抗ウサギ抗体またはHRP-コンジュゲートD抗マウス抗体1:10,000でそれぞれGFP及びHAC1検出のための1時間、のため。 </li><li>スーパーシグナルウェスト·ピコ化学発光基質を用いてウエスタンブロットを処理します。 </li><li>タンパク質のバンド強度を分析し、バンドに校正量を得るために、GeneToolsソフトウェアを使用してください。 </li></ol>タンパク質生産：（サンプルの校正済み数量×希釈）/ロードしたサンプルの量）が4 = mg / kgでのX。 式：タンパク質産生（P）、キャリブレーション量（C）、試料の希釈（D）とサンプル装填（S）の量。 6。ザイモグラムアッセイ<ol><li> pBID4-LicKM浸潤Nを集めるベンサミランダム組織サンプル。 </li><li>ウェスタンブロット分析のために上述したのと同じ方法を用いてタンパク質を抽出した後、0.1％リケナンで10％SDS-PAGEによって分析し、ゲルに含まれる。 </li><li>電気泳動後、100mMのトリス-HCl [pH8.0の]及び0.1％トリトンX（洗浄緩衝液中で10分間ずつ2回ゲルを洗浄-100）、次いで1時間65℃で洗浄緩衝液中でインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、洗浄緩衝液を廃棄し、室温で5分間、0.5％コンゴーレッドでゲルを染色する。 </li><li>ミリQ水にゲルを10分間ずつ3回すすぎ、そしてリケナーゼ活動を可視化するために1MのNaClを追加します。精製された細菌リケナーゼ蛋白質は、酵素活性の陽性対照として使用した。 </li></ol> 7。のGFPイメージング<ol><li>ハンドヘルド長波長UVランプを用いて全体の一過性形質転換植物におけるGFP蛍光の視覚的検出を行う。 </li><li>写真は一過性黄8を介してデジタルカメラで植物を形質転換し、52フィルタ（露光時間、15秒）ES。 </li><li>ウエスタンブロットの画像を取得するGeneGnomeにGeneSnapソフトウェアを用いて解析し、精製したGFP規格に基づいて検量線と、GeneToolsソフトウエアを使用して結果を定量化する。 </li><li> purifiに基づく検量線を使用して、HAC1タンパク質を定量するインフルエンザウイルスのA/Indonesia/05/05株由来HACタンパク質標準エド。 </li><li> 3から4の平均値を計算するには、すべての実験のために複製されます。 </li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

本研究では、発射ベクターを有するアグロバクテリウム株を使用して、選択Nicotiana種におけるルーチン一過性タンパク質生産のための単純なアグロインフィルトレーションプロトコルを開発した。加えて、我々は、一過植物発現系で最も高い組換えタンパク質生産レベルを達成するための最適な条件を同定した。 希釈されたAの真空浸透はNに打ち上げベクトルpBID4を保有する菌株GV3101 ツメファシエンスベンサミアナ、N. excelsianaおよびN.木毛は、例えば、アルファルファモザイクウイルスを宿すGV3101で浸潤エンドウなどの他の植物種と比較して7解像度内の標的タンパク質産生のより高いレベルをもたらした-又はキュウリモザイク 35Sプロモーター下にGFPレポーター遺伝子を発現するウイルスベースのベクター41、またはレタス 、 ナスlycoAのC58C1株で浸潤persicumとシロイヌナズナベータ-グルクロニダーゼレポーター遺伝子57。N.を担持ツメファシエンスベンサミアナとN excelsiana 90〜95％の浸透効率で、30〜60秒間、50ミリバールで潜入真空に容易であった。葉面積の残りの5から10パーセントがあるため、真空の適用中にアグロバクテリウム懸濁液の表面上の葉のいくつかの浮遊浸透していなかった。発射ベクターは細胞間移行能力18を有しているため、一過性タンパク質の蓄積は、全体の葉並びに7 dpiで葉柄で起こる。 pBID4発現ベクターが細胞から細胞へ移動可能であるが、全身18は移動しないので、10 dpiで、推定されたGFP産生がわずかに低かった;従って、新たに成長した葉がベクターを含まないターゲットの生産に寄与しない。加えて、組換えタンパク質の分解以上の時間mAY 10 dpiで還元されたタンパク質レベルに貢献しています。我々の結果は、Aと浸潤を示したN.における一過性タンパク質生産のツメファシエンス株 GV3101媒介高レベルベンサミ 。さらに、標的タンパク質は、リケナーゼするN-末端、C末端または内部融合物（LicKM）、β-1 ,3-1、4 -グルカナーゼ、 クロストリジウム·サーモセラム由来の熱安定性酵素であり、多くの標的に耐熱性を付与するように操作することができるタンパク質融合18。 Nの浸潤Aとベンサミ目的の遺伝子を保有するツメファシエンス野生株（AT6、AT10とat77）は、軽度または重度の症状を誘発：葉のカーリング、葉柄の伸長、およびカーリング。病理学的症状は、Nは観察されなかったいくつかの遺伝子がpBID4に挿入し、研究室に変身しながら、空のpBID4ベクターを有する実験室株のGV3101で浸潤ベンサミが GV3101を株C58C1またはLBA4404は、軽度の壊死性応答と葉を誘発クロロシス/葉の浸潤地域で症状を黄変。ナス科の植物で、野生型アグロバクテリウムや武装解除の株によって引き起こされる壊死性の症状は、以前に56,57に報告されている。壊死性応答は、III型分泌系、IV型分泌系によって植物細胞に移し、細菌タンパク質、および/ ​​またはフラジェリン58-60に対する感受性の病原性因子に起因する可能性がある。我々は、異種タンパク質の一過性産生はまた、病原性を誘発することができ、浸潤植物における過敏感反応が出ることを見出した。多くの研究者が、過渡タンパク質産生の5〜20倍高いレベルまで産植物バイナリーベクターを有する異なる植物種のアグロ浸潤は、安定に形質転換された植物28,57と比較したことを報告した。我々のデータは、N.ことを示しているpBID4-GFPを保有するGV3101で浸潤ベンタミアナは一過に対して報告GFP収量に似て、GFPの高いレベルで発現し（全可溶性タンパク質の80％まで）PICH-GFPSYSウイルスベクターを有するアグロバクテリウム 44を浸透させたN.benthamiana。我々の発射ベクターを用いてアグロインフィルトレーション、熱安定性蛋白質LicKMの高い生産をもたらし、標準的なバイナリープラスミド18を用いて観察されるよりも高い50倍。 Aの感染性をテストするにはツメファシエンス及び発射ベクトルの安定性は、我々はNの1フラットに潜入ベンサミ pBID4-GFPプラスミドを保有するGV3101同じミリQ水で薄めたカルチャを使用して、最大8時間の1時間ごと。我々のデータは、GV3101株を効率的に少なくとも8時間、感染性れ、pBID4（発射ベクター）は8時間にわたる浸潤の間に非常に安定である。ことを示した -80℃で保存発射ベクターpBID4-HAC1（細胞バンク）を宿すGV3101株のグリセロールストックを、過渡proteを変更せずに三年間非常に安定であることが示されている浸透させ、植物の生産において。 最適な条件下で増殖させたN.benthamiana植物と35〜42日後に播種は、真空浸透媒介一過性遺伝子発現40のための最適であった。 （3-4週齢）の若い植物は、真空を適用するための機械的な影響から細胞懸濁液表面および組織損傷に浮かぶ葉完全に浸透させることができない。 45日以上経過した植物では、N.ベンサミアナタバコを用いる最適な光条件の下で、ステージをボルト締め、一過性の発現のレベルは低い。 低分子フェノール化合物（アセトシリンゴン）およびmonosaccharaides（グルコース）55,61はA. ツメファシエンスにvir遺伝子を誘導することが知られている。 N.はまた、浸潤50〜600μMの濃度のシリンゴンの存在下で、バイナリーベクターpCAMBIA（GFP）とベンサミわずかに一過性に増加させることが示された遺伝子発現40。私たちは、3時間のMMAでpBID4-GFPを保有するGV3101培養物にこれらの化合物を添加することにより、我々のシステムにおけるシリンゴンとグルコースの異なる濃度の効果を研究し、GFPの発現に差は認められなかった。興味深いことに、GV3101培養pBID4-GFPを保有し、0.5の600にミリQ水で希釈し、VIR遺伝子誘導なしに浸潤し、誘導された培養液を浸透させたものとGFPの同じ量を表明した。 A.ツメファシエンスのvirの遺伝子は、潜在的に植物フェノール化合物（アセトシリンゴンおよびシナピン酸）および葉組織中に存在する植物monosaccharaides（グルコース及びフルクトース）によって誘導することができる。したがって、我々は、外因性のvir遺伝子誘導物質の存在下または非存在下でGFP発現の同様のレベルは、植物細胞におけるGFP発現発射ベクターの複製の間に存在し、細胞質のvir遺伝子誘導物質の作用の結果であり得ると推測している。 N.ベンタミアナは、過渡タンパク質産49のモデルを宿主として使用されてきた。しかしながら、N.ベンタミアナの比較的低いバイオマス収量は、組換えタンパク質の大規模生産への応用を妨げる。最適なホストは、一過性の高レベルの発現を組み合わせ、温室内の容易な成長、およびアグロバクテリウム浸潤2の影響を受けやすくする必要があります。代替ホストを選択するために、我々は2 タバコ（N.ベンサミアナ及びN.エクセルシオール ）の異なる野生型種とハイブリッドNを浸透させAとexcelsiana（N.エクセルシオール×N.ベンタミアナ ） pBID4-GFPプラスミドを保有する菌株GV3101 ツメファシエンス 。これら三つの種の中でも、GFP発現のレベルは、N.でわずかに高かったベンサミアナ。N.エクセルシオール植物は、それらの革のリーフに真空アグロインフィルトレーションの難しさを示し、N. excelsianaほぼ同一の増殖条件下よりバイオマスを2倍生じた。 7 dpiでGFPの一過性の生産は、Nに比較的似ていますベンサミアナとN excelsiana。したがって、N. excelsianaは、組換えタンパク質生産のためのより適切な宿主であり得る。 アグロバクテリウム媒介性一過性のタンパク質産生は、植物ウイルス由来の62遺伝子サイレンシングサプレッサーの共発現によって克服することができるPTGS 26によって制限される。一過性のタンパク質産生は、以前に浸潤組織34でPTGSを抑制するTBSVのp19のタンパク質の存在下で50倍に増強することが示されている。私たちの研究では、別々に打ち上げベクトルpBID4-HAC1との共浸潤し2つのウイルスサイレンサプレッサー（p19およびP23）の効果を評価した。これらのサイレンシング抑制因子の共同浸潤はHAC1のわずかな増加と、HAC1の一過性の発現にはほとんど影響を持っているように見えた共同浸潤P23やP19の存在下でのタンパク質の蓄積（15〜25％）。正にタンパク質産生に影響を与えるために、サイレンシングサプレッサーを特異的に標的植物種およびウイルスベクター63に有効であるように選択される必要があり得る。 TMVヘリカーゼは、RNAサイレンシング活性64,65の抑制因子を持っています。 pBID4-HAC1とP23やP19の共同浸潤がGFP無しの増加や一過性のHAC1タンパク質産生のわずかな増加をもたらしたように我々のデータは、この観察を確認する。 結論として、我々は、修飾された、最適化された植物およびアグロバクテリウム増殖条件および真空浸透の効率が改善されている。この技術は、数時間で植物材料のキロ数百人を成長させ、浸透させることができました。我々は成功し、現在の適正製造基準（cGMP）の条件の下で、工業規模での高スループットのワクチン生産のための植物の一過性発現技術を自動化しました。 ABO詳細についてut個の自動化およびcGMP条件下でのサブユニットワクチン候補を含む組換えタンパク質の生産のためのプラント過渡タンパク質産生システムの利用は、読者がウェブサイトと呼ばれる<a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> 。

植物は現在、異種組換え生物医薬品を製造するための、安全で信頼性が高く、拡張性の高い、安価なプラットフォームとして認識され、工業用タンパク質1-3及び微生物や動物細胞発現系4を介して重要な利点を持っている。植物は、組み立てられた多量体抗体5-7を含む翻訳後修飾、と正しく折り畳まれたタンパク質を発現することができる。いくつかの植物由来の組換え医薬タンパク質は、臨床評価8を受けている。これらは、非ホジキンリンパ腫9、赤血球凝集素ベースのパンデミックと季節性インフルエンザワクチン候補10,11（カミングスら、Vaccineに提出）、抗連鎖球菌表面抗原Iの治療のための患者特異的組換えイディオタイプワクチン（scFv）を含む糖尿病の治療のために13虫歯12、およびヒトインスリンの治療のために/ II抗体。さらに、ヒトRECOゴーシェ病患者の酵素補充療法のためのmbinantグルコセレブロシダーゼは、イスラエルと米国で承認され、米国の14,15の外に拡大アクセスプログラムの下で提供されています。 異種タンパク質は、安定的に形質転換（トランスジェニックまたはtransplastomic）または一過性に形質転換植物で生産することができる。一過性のタンパク質産生、発現および蓄積16を達成するために、短い時間枠を含む、トランスジェニック植物において産生に比べていくつかの利点を提供し、植物組織4内細菌バイナリーベクターまたは組換え植物ウイルスベクターを導入することによって達成することができる。最も先進的な一過性発現系は、植物ウイルスおよびバイナリプラスミドの成分を組み合わせ、アグロインフィルト17,18によって送達される「発射ベクター」の使用に基づいている。 タバコモザイクウイルス （TMV）に基づいて、発射ベクターのアグロ浸潤が正常に研究室で適用されている例えば、ヒトパピローマウイルス19、 ペスト菌 20などの病原体に対するワクチン抗原を産生するように拡張、インフルエンザは21,22、 炭疽菌 23をウイルス、およびNに天然痘ウイルス24 ベンタミアナの葉。 アグロバクテリウムによる一過性発現は、複数のタンパク質2,25-27の同時生産のための有望な方法である。例えば、植物一過性発現系は、腫瘍特異的な組換え抗体28,29、上皮細胞増殖因子受容体30に対するグリコシル化組換え抗体、および炭疽菌防御抗原31,32に特異的なモノクローナル抗体を産生するために使用されてきた。標的遺伝子および強化標的タンパク質発現33,34における遺伝子サイレンシングのサプレッサー結果とベンサミアナタバコ植物の同時浸潤。 アグロ浸潤が均一introduするための一般的な方法です。植物組織35〜37に目的の遺伝子を保有するcing細菌。無傷の植物における一過性の遺伝子発現のための葉のアグロバクテリウム減圧浸潤は、トランスジェニック植物38-41を生成する必要なく、外来タンパク質の産生のために、迅速なスケーラブル、かつ有用な方法である。真空アグロ浸潤の間に、植物が逆さまに反転され、地上部は、 アグロバクテリウム懸濁液中に沈め。その後、真空をガスが気孔を通して葉細胞間隙から避難させる適用されます。葉へのアグロバクテリウム懸濁液の注入の真空結果の迅速な再加圧以下のリリース。 アグロバクテリウムの減圧浸潤に続いて、植物はさらに栽培されており、ターゲット式が監視されている。ターゲット発現の最高レベルは、通常、2〜3日は、バイナリーベクターと発射ベクターと4-7解像度と浸潤（DPI）、後の発現量、通常decreaを投稿観測されるゲ17,18,42-45。 アグロバクテリウム·ツメファシエンスは、タンパク質産生のために植物に目的の遺伝子を送達するための最も広く使用されている車両である。アグロ浸潤はNに非常によく動作しますベンサミ比較的貧弱シロイヌナズナ 46を含む他のほとんどの植物にある。 本研究では、5〜6週齢のN.過渡タンパク質生産のための、単純、効率的、かつ経済的な方法を開発A.を用いてベンサミアナ浸潤ツメファシエンス 。 （N-モルホリノ） -アグロインフィルトレーション法の工業的スケールの主な欠点は、採取し、細菌および4&#39;-ヒドロキシ-3 &#39;、5&#39;-ジメトキシアセトフェノン（アセトシリンゴン）、単糖類、および2を含む培地で細菌ペレットの再懸濁、遠心分離である-エタンスルホン酸（MES）vir遺伝子の誘導のためのバッファ。我々は、 アグロバクテリウムを最適化することによりこれらの問題を克服することができた</em&gt;のAB培地（最小培地）での増殖を直接のMilli-Q水に浸潤時間と条件を制御することによって希釈した。また、野生型タバコ宿主種のN.中の標的タンパク質の産生を比較しました。 ベンサミアナとNエクセルシオールだけでなく、ハイブリッドNにexcelsiana。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana benthamiana</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555478 TW16</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsior</td>
			<td style="width:221px;">Tobacco Germplasm Collection, Crop Science Dept., North Carolina State University</td>
			<td style="width:119px;">PI 555685 TW47</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nicotiana excelsiana</td>
			<td style="width:221px;">Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA</td>
			<td style="width:119px;">LSBC EBA 042304.02</td>
			<td style="width:236px;">Infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum skid</td>
			<td style="width:221px;">Abbas, Ashland, MA</td>
			<td style="width:119px;">Custom made</td>
			<td style="width:236px;">Plant infiltration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rockwool</td>
			<td style="width:221px;">Grodan Inc., Ontario, Canada</td>
			<td style="width:119px;">AO 50/40</td>
			<td style="width:236px;">Hydroponic media for growing plant</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid</td>
			<td style="width:221px;">Acros Organics, Thermo Fisher Scientific&#160; 
			NJ</td>
			<td style="width:119px;">172595000</td>
			<td style="width:236px;">Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog salt (MS salt)</td>
			<td style="width:221px;">Phyto Technology Lab</td>
			<td style="width:119px;">M524</td>
			<td style="width:236px;">Tissue culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">D134406-5G</td>
			<td style="width:236px;">Agrobacterium induction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Immobilon-P transfer membrane</td>
			<td style="width:221px;">Millipore, Billerica, MA</td>
			<td style="width:119px;">IPVH00010</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">I-block</td>
			<td style="width:221px;">Applied Biosystems, Foster City, CA</td>
			<td style="width:119px;">T2015</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Rabbit polyclonal anti-GFP antiserum&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Washington Biotechnology, Baltimore, MD&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mouse anti&#8211;poly-histidine monoclonal antibody</td>
			<td style="width:221px;">Qiagen GmbH, Hilden</td>
			<td style="width:119px;">34670</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:221px;">Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SuperSignal&#174; West Pico chemiluminescent substrate</td>
			<td style="width:221px;">Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td>
			<td style="width:119px;">34078</td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)</td>
			<td style="width:221px;">Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P-LICHN</td>
			<td style="width:236px;">Lichenase Activity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Congo Red&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:119px;">C6277&#160;</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Digital camera&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Olympus, Center Valley, PA</td>
			<td style="width:119px;">C-8080</td>
			<td>Chemiluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneGnome</td>
			<td style="width:221px;">Syngene, Frederick, MD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GFP standard&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Made in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chemiluminescence imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plant fertilizer solution</td>
			<td style="width:221px;">Griffin Greenhouse &#38; Nursery Supplies, Newark, DE</td>
			<td style="width:119px;">67-23-20</td>
			<td>Plant growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lichenase Standard</td>
			<td style="width:221px;">Purified in house&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:236px;">Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:221px;">BioRad, Hercules, CA&#160;</td>
			<td>165-2100</td>
			<td>Agrobacterium transformation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization and utilization of agrobacterium-mediated transient protein production in nicotiana

植物におけるアグロバクテリウム媒介性一過性タンパク質産生は、短時間のうちに、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を産生するための有望なアプローチである。しかし、この技術は単にスケールアップするために多くの技術的障害が克服されている現在の大規模生産に適用され始めている。ここでは、発射ベクターを有するアグロバクテリウムを有するタバコ植物の真空浸潤に基づいて、工業規模の一過性タンパク質生産のための単純かつ再現性のある方法を示す。 AB培地中のアグロバクテリウム培養の最適化は、浸透プロセスを簡素化、ミリQ水中の細菌培養物の直接希釈を可能にする。 ニコチアナ、Nの3試験を種間でexcelsiana（N.エクセルシオール×N.ベンタミアナ ） が原因浸透のしやすさに最も有望なホストとして選ば ​​れた、高レポータータンパク質の産生のレベル、および約2-F制御された環境条件の下で、古い高バイオマス生産。例えば、アセトシリンゴン及び単糖等の化学薬品を使用してpBID4-GFP（ タバコモザイクウイルス系）を保有するアグロバクテリウムの誘導は、タンパク質産生レベルに影響を及ぼさなかった。 30または60秒間の50〜100ミリバール下浸潤植物は、植物の葉組織の約95％の浸潤をもたらした。 アグロバクテリウム実験室株のGV3101との浸潤はアグロバクテリアの実験室株LBA4404とC58C1と野生型アグロバクテリアは at77とA4、AT10、AT6菌株に比べて最も高いタンパク質産生を示した。 NにウイルスRNAサイレンシングサプレッサー、P23やP19の共発現、 ベンサミアナタバコは、標的タンパク質（インフルエンザウイルス血球凝集素）の以前の蓄積および増産（15〜25％）が得られた。

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Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因子を共導入することにより、目標蓄積を改善した。

最適化と利用の<em&gt;アグロバクテリウム</em中&gt;媒介一過性タンパク質産生<em&gt;タバコ</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

41.0K ビュー.  Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology.  アグロバクテリウムは、（タバコモザイクウイルスベース）の起動ベクタを運ぶと真空浸透に基づいてタバコ植物での一過性のタンパク質生産は、ワクチン抗原および治療 ​​用タンパク質を生産するための迅速かつ経済的なアプローチです。我々は、手順を簡略化し、細菌培養の条件を最適化する宿主種の選択、RNAサイレンシング抑制因...

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Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFR&#945;, etc.). We are able to model and study a human-like disease in our mouse model, by transplanting bone marrow cells previously infected with a retrovirus expressing the oncogene of interest. Replication-defective retrovirus encoding a human oncogene and a marker (GFP, RFP, antibiotic resistance gene, etc.) is produced by a transient transfection protocol using 293T cells, a human renal epithelial cell line transformed by the adenovirus E1A gene product. 293 cells have the unusual property of being highly transfectable by calcium phosphate (CaPO4), with up to 50-80% transfection efficiency readily attainable. Here, we co-transfect 293 cells with a retroviral vector expressing the oncogene of interest and a plasmid that expresses the gag-pol-env packaging functions, such as the single-genome packaging constructs kat or pCL, in this case the EcoPak plasmid. The initial transfection is further improved by use of chloroquine. Stocks of ecotropic virus, collected as culture supernatant 48 hrs. post-transfection, can be stored at -80&deg;C and used for infection of cell-lines in view of transformation and in vitro studies, or primary cells such as mouse bone marrow cells, that can then be used for transplant in our mouse model.

This technique demonstrates an efficient way to prepare replication-defective retroviral stocks encoding a human oncogene, and subsequently used for induction of myeloproliferative disease in the mouse model.

293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

Our lab studies human myeloproliferative diseases induced by such oncogenes as Bcr-Abl or growth factor receptor-derived oncogenes (ZNF198-FGFR1, ...

生物学

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

コットンでアグロバクテリウムを介したウイルス誘発遺伝子サイレンシングアッセイ

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

アグロバクテリウム-形態新生遺伝子を用いた再カルシトランストウモロコシ近交線の媒介性不成熟胚変態

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

アグロバクテリウム-媒介遺伝子変換、トランスジェニック産生、および米における男性生殖発達の研究への応用

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

ニコティアナ・ベンタミアナで一過性発現するIgG融合タンパク質の製造

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...