この新しいスフェロイド培養法は、がん幹細胞の異なる集団の存在を分析するために腫瘍原性を研究するために使用することができ、また、新薬の高いプットスクリーンを通じてうまく適用することができます。これは、多数の均質なサイズのスフェロイドを生成するための堅牢で反復的な培養システムです。また、これらのスフェロイドは、癌性幹細胞を研究するために使用することができる。
この方法は、慢性癌生物学を研究するために設定されていますが、3D培養条件を変更することによって他の癌を研究するために簡単に設定することができます。スフェロイドの形成中にプレートをあまり動かさないように、ストレーナーにスフェロイドを収穫する際には注意してください。井戸ごとに500マイクロリットルの抗付着リンス溶液で24ウェルプレートのウェルを事前に処理することで始めます。
数秒後、スイングバケットローターでプレートを遠心し、2ミリリットルの温かい基底培地で各ウェルスリンスします。マイクロウェルから泡が完全に取り除かれていることを確認するために顕微鏡の下でプレートを観察します。気泡が見られない場合は、各ウェルに暖かいDMEM基膜マトリックス培地の1ミリリットルを追加する前に、再びウェルをすすいします。
スフェロイド形成を誘導するには、10%FBSおよび1%抗生物質を補ったDMEMの10センチメートル皿の2Dモノ層におけるCaco-2細胞の所望の濃度を参照してください。加湿雰囲気の中で摂氏37度と5%の二酸化炭素の培養のため。80%の合流度に達したら、37°Cと5%の二酸化炭素で2ミリリットルのトリプシン-EDTAで培養を処理する前に、PBSの5ミリリットルで細胞を洗浄します。
細胞が切り離されたとき完全なDMEMの4ミリリットルでトリプシンを中和する。カウント後、遠心分離によって細胞を収集し、DMEM基膜マトリックス媒体の適切な体積でパレットを再中断し、ウェル当たり1ミリリットルの培地で所望の濃度の細胞を達成する。プリペイド24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞を加え、続いてDMEM基膜マトリックス培地を各ウェルに1ミリリットル添加する。
播種後、すぐにプレートを遠心分離し、軽い顕微鏡を使用して、細胞がマイクロウェル全体に均等に分布していることを確認します。その後、細胞を乱すことなく48時間細胞培養インキュベーターにプレートを入れます。スフェロイドを収穫するには、インキュベーションの終わりに、血清ピペットと上清の半分を各ウェルに使用して、スフェロイドをマイクロウェルからそっと取り除きます。
すべてのスフェロイドが取り外された場合、ピペットを使用して、各ウェルから15ミリリットルの円錐管の上にある37ミクロンのリバーシブルストレーナーに3D培養物を慎重に移します。残りのスフェロイドを収集し、ストレーナーにこれらの追加のスフェロイドを追加するために、洗浄ごとに1ミリリットルのプリウォーム付きBasal培地でそれぞれ3回洗浄します。最後の洗浄後、顕微鏡下でプレートをチェックし、すべてのスフェロイドがマイクロウェルから取り除かれたことを確認します。
その後、新しい15ミリリットルのチューブの上にストレーナーを反転し、チューブにスフェロイドを収集するために新鮮なDMEM基底膜マトリックス媒体でストレーナーの底部を洗浄します。500細胞から上昇するスフェロイドは、時間の経過とともに最も均質なサイズの増加を示しています。スフェロイド当たり500個と600個の細胞で、良好な増殖と低ばらつきを達成できる最適な細胞数であると判断します。
基質膜マトリックスの添加は、スフェロイドの成長と均一性を高めます。長期培養では、細胞は3日目に密な多層として現れます。平坦化された細胞はモノ層に配置され、10日目にははっきりと見える。
興味深いことに、5日目以降、回転楕円体の中にルーメンが現れます。また、核抗原陽性細胞の増殖の明らかな増加は、10日目までに減少する5日目と7日目に観察される。驚くべきことに、活性化されたCaspace 3は、3日目と5日目のみにおいて非常に少数の細胞において観察される。
β-カテニン発現の高レベルは、各時点で観察されている間.アンテロサイトに分化するスフェロイドの可能性は、アルカリホスファターゼおよび溶質キャリアファミリー2A5 mRNA発現によって証明される。さらに、このスフェロイドは、典型的な癌幹細胞マーカーを発現し、大腸癌患者に日常的に投与される併用化学療法治療に応答する。
したがって、スフェロイドは異なる細胞集団で構成されています。その後、屈折剤などの刺激に対する細胞特異的応答を分析し、最終的には薬物反応に対してうまく使用することができます。
