このプロトコルは、消化器系およびまたは排泄系を調節する神経ペプチドおよび他のホルモン因子の役割を解明するために小動物生理学者によって利用され得る技術を記述する。これらの技術は、例えばげっ歯類およびテレウスを含むより大きな動物モデル用に特別に設計された技術を使用しては不可能であろうマイクロサイズの生物学的サンプルの測定を可能にする。この方法は、昆虫および同様のサイズの非昆虫種における上皮および胃腸管に関連する平滑筋の輸送を含む、腸の内分泌調節に関する洞察を提供することができる。
昆虫腎尿細管の手順を実証するのは、私の研究室の博士候補であるFarwa Sajadiです。さらに、私の研究室の元大学院生アーリアン・ラジェヴァルディが、後腸に焦点を当てたプロトコルを実証します。実験用のラムゼイおよび収縮アッセイ皿を準備することから始めます。
ピペットを使用し、ウェルに最大20マイクロリットルの溶液を充填します。無刺激対照の場合、ウェルを20マイクロリットルのヒトスジシマカ生理食塩水シュナイダー培地で満たします。すべてのウェルが満たされたら、ウェルとミヌティエンピンが水没するまで、水和鉱物油をアッセイ皿に注ぎます。
細管を井戸に浸した後、鉗子で細管の近位端を拾い上げ、入浴液滴から取り出し、端をピンに巻き付けます。チューブをピンに2回巻き付けて、入浴液滴に残っている細管の長さを他のチューブと一致させます。ナトリウム選択的微小電極を作るには、1ミリリットルのシリンジを使用して、電極に100ミリモルの塩化ナトリウムをバックフィルします。
バックフィル溶液が電極の先端まで充填されていることを確認します。気泡が現れた場合は、微小電極を軽くフリックするか、溶液を取り出して補充してください。10マイクロリットルのピペットチップをナトリウム選択イオノフォア溶液に浸します。
電極をピペットに垂直に整列させ、手袋をはめた指を先端の底の上に置き、圧力を作り出し、少量のイオノフォアを排出します。イオノフォアの滴を微小電極の先端に注意深く触れ、それを壊さないようにしてください。小さなビーカーに100ミリモルの塩化ナトリウムを半分入れ、ビーカーの上部にある内側にモデリング粘土を置きます。
イオノフォアを取り上げたら、電極チップをビーカーの壁に置き、チップを塩化ナトリウムの中に入れます。ISMEは、使用する準備ができるまでビーカーに入れたままにしておきます。ISME参照電極を作るには、電極に500ミリモルの塩化カリウムをバックフィルし、ビーカーに保管します。
パラフィンオイルに沈んだときのイオノフォアの変位を避けるために、テトラヒドロフランに溶解した約3.5%のポリ塩化ビニルの溶液を使用して電極先端をコーティングする。ナトリウム電極を較正するために、インキュベートされたマルピーギ尿細管を有するラムジー皿の端に、標準濃度の塩化ナトリウムの10マイクロリットルの液滴を置く。標準液滴を2センチ離して、濃度の高いものを上に置きます。
参照電極とイオン選択電極の両方を塩化銀線の上に挿入し、マイクロマニピュレータに取り付けられた電極ホルダーを使用してしっかりと固定します。マイクロマニピュレーターを使用して両方の電極を200ミリモルの塩化ナトリウム液滴に向かって移動させ、電気先端が皿の底に触れないようにします。エレクトロメーターをオンにして録音を開始し、読み取り値を安定させます。
読み取り値を記録し、次の標準に進みます。流体分泌速度の測定値を取得した後、マイクロマニピュレータを使用して、基準電極とイオン選択電極を分泌液滴に慎重に移動させます。記録をオンにし、読み取りが安定するようにしてから、記録します。
IPA-2イオン/ポラログラフィックアンプ、光学顕微鏡、およびコンピュータの電源を入れます。塩化銀線からなるホルダーにナトリウム選択微小電極を置き、メスコネクタジャックに取り付けます。塩化カリウムを入れたビーカーから参照電極を1つ取り出し、片方の指を1本ずつ置き、寒天が落ちないようにガラスキャピラリーをこの指に向かって傾けます。
片方の端をホルダーに慎重に置き、泡が形成されないようにします。気泡がある場合は、参照電極を取り外し、ホルダーに3モルの塩化カリウムを補充して繰り返します。電極ホルダーをメスコネクタジャックに差し込みます。
較正後、器官を解剖する。解剖した試料の入ったポリL-リジン皿を顕微鏡ステージ上に置き、参照電極の先端を生理食塩水の内部に挿入する。イオン選択微小電極の先端を生理食塩水に沈め、先端を壊さないように注意する。
手動調整ノブを使用して、光学顕微鏡の下を見ながら微小電極の位置を調整します。微小電極の先端が器官または組織と同じ平面上にあるように微小電極の垂直位置を調整し、モータースイッチを回して有効にします。コンピュータの矢印キーを使用して、マイクロ電極を組織から3ミリメートル離れた位置に水平に動かし、バックグラウンド記録を測定します。
準備ができたら、F5を押して記録を開始し、バックグラウンドアクティビティの5つの測定値を取得します。微小電極先端部を組織に近づけて、臓器を突き刺さないように注意する。キーヒット感度を下げて、マイクロ電極チップを2マイクロメートル右に直接、組織に対して垂直に配置します。
直腸パッドに沿った部位で3つの記録を取得して、最もイオン活性の高い部位を特定し、次いで、最も活性を示す部位でベースライン生理食塩水測定値を得る。後腸の収縮を記録するには、皿の井戸の1つを既知の量のヒトスジシマカの生理食塩水で満たします。解剖後、中腸に付着した解剖後腸を別の皿の井戸に慎重に移し、回腸をつまないようにします。
井戸の中の生理食塩水に腸を浸し、ミヌティエンピンを腸の真ん中と直腸に入れます。回腸は緊張状態であってはならず、前回腸の幽門弁に由来する自発的な収縮が観察されるべきである。ビデオカメラを実体顕微鏡に接続します。
次に、解剖した臓器を含む皿を顕微鏡下に置き、ビデオを2分間録画する。無刺激マルピーギ尿細管に対するDH31の適用は、体液分泌速度の有意な増加をもたらし、ヒトスジシマカにおける利尿ホルモンとしての役割を確認する。細管をAedaeCAPA-1で処理すると、DH31刺激マルピーギ尿細管において分泌速度の低下が観察される。
イオン選択電極は、分泌された液滴中のナトリウム濃度を測定するために使用した。MTsに対するDH31の処理は、分泌された液滴中のナトリウム濃度に影響を及ぼさなかった。しかし、AedaeCAPA-1の適用により、分泌液中のナトリウム濃度は有意に増加した。
さらに、非刺激対照と比較して、DH31は有意に高いナトリウム輸送速度をもたらしたが、AedaeCAPA-1はDH31刺激尿細管のこの増加を消失させた。SIETは、成体雌蚊の直腸パッド上皮に沿ったナトリウム輸送の変化を評価するために使用された。ロイコキニン類似体を用いてナトリウム吸収の変化を調べたところ、生理食塩水対照と比較してナトリウム吸収が4倍減少した。
回腸運動性に対する神経ペプチドピロキニン2の役割を評価するために、蚊回腸に富むA.aegypti PK2受容体を活性化することが以前に示されたRhodnius prolixus類似体を使用した。ベースラインレベルと比較して、PK2は回腸収縮を有意に阻害する。マルピーギ尿細管を用いてラムゼイアッセイを実施し、イオンまたは流体の分泌速度を測定する場合、解剖中またはアッセイ皿への移送中に細管が損傷を受けないことが不可欠です。
Ramsayアッセイに続いて、特定の膜トランスポーターを、逆遺伝学的手法を使用して薬理学的または分子的に標的化し、単純な上皮における溶質の経上皮輸送に対するそれらの特異的な寄与を識別することができる。
