BWレポーターシステムは、受容体とリガンドの相互作用を研究することができます。特定の受容体のリガンドが未知の場合や、内因性リガンドを用いた実験が技術的に困難な場合には極めて有用である。この方法は、個々の受容体に対して敏感かつ特異的であり、操作しやすく、再現性が高い。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクであるシラ・カーロンです。トランスフェクションの前日には、10ミリリットルの10ミリリットルのプレート10プレート、000 BW5147細胞、およびRPMIを補う。その後、pcDNA3プラスミドの100マイクログラムをチューブに入れる。
pH 5.3で酢酸ナトリウムをチューブに加えます。この後、プラスミド混合物に2.5容量の100%エタノールを加える。その後、プラスミド混合物をマイナス20度で一晩インキュベートします。
BW細胞をめっきしてから24時間後、2本の50ミリリットルチューブに細胞を集める。その後、515gの細胞を5分間遠心し、上清を捨てます。ペロトンRPMIを追加せずに再中断し、遠心分離を繰り返します。
得られたペレットを1ミリリットルのRPMIで添加せずに再懸濁する。再懸濁したペレットを氷上の4センチメートルのキュベットに移します。エタノール沈殿を受けたプラスミドを遠心分離する。
その後、プラスミドを70%エタノールの1ミリリットルで洗浄する。そして、さらに20分間遠心分離を繰り返します。エタノールをすべて取り除き、ペレットを部分的に乾燥させます。
その後、ペレットを予熱されたRPMIの100マイクロリットルで再懸濁し、添加しない。この後、再懸濁されたプラスミドをキュベットの細胞に加える。氷上の細胞を5分間インキュベートします。
次に、セルを電気ポレートします。その後、電気ポポレートされた細胞を50ミリリットルのチューブに移します。515 gで、チューブと遠心分離機に50ミリリットルの完全な培地を5分間加えます。
上清を捨て、完全培地の50ミリリットルで細胞を再懸濁する。その後、24ウェル培養皿に細胞をプレートし、48時間培養します。この後, 完全な培地の 1 ミリリットルを追加, で補います 10 各ウェルに G418 のミリリットルあたりミリグラム.
48時間後、各ウェルの上の体積の1ミリリットルを捨てます。その後、各井戸にG418のミリリットルあたり5ミリグラムで補った完全な培地の1ミリリットルを追加します。96ウェルプレートの単一のウェルで、所望の標的を持つ50,000個のトランスフェクトされたBW細胞を使用してください。
プレートを48時間インキュベートします。その後、マイナス20度でプレートを凍結します。ELISAプレートに抗マウスIL-2抗体をコーティングします。
05マイクログラムの抗マウスIL-2を各ウェルに50マイクロリットルのPBSの体積に入れる。コーティングされたプレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。摂氏37度で短いインキュベーション期間を使用して、以前に標的と共にインキュベートされた凍結したBW細胞を解凍する。
次いでプレートを遠心分離し、各ウェルから100マイクロリットルの上清をプレコーティングされたELISAプレートに移した。そして、2時間摂氏37度でインキュベートします。この後、ビオチン抗マウスIL-2をELISAプレートに添加した。
次いで、インキュベーションと洗浄後、HRPコンジュゲートストレプトアビジンをプレートに加えます。インキュベーションおよび洗浄後、TMB基質溶液の100マイクロリットルを、ELISAプレートの各ウェルに加える。最後に650ナノメートルでELISAプレートを読み取ります。
この例では、CLL細胞を、異なる抗CD20抗体で事前インキュベートした。そして、ELISAで分析される前に、Fc受容体CD16を発現するトランスフェクトBW細胞と共インキュベーションした。ELISAによる分析後、結果を定量化した。
光学密度レベルを、標準曲線に基づいてマウスIL-2濃度に変換した。追加の実験では、異なる用量の抗CD20抗体をCLL細胞で事前インキュベートした。そして、トランスフェクトされたBW細胞と共にインキュベートした。
パーティクルには 4 つの主要な部分が含まれています。クローニング、BW細胞のトランスフェクション、活性化およびELISA。各パーツは個別に検証する必要があります。
この手順に従って、NK細胞との相互作用を研究するためにNK細胞を用いた酸を殺すなどの内因性受容体を発現する細胞を用いて、追加の実験を行うことができる。このシステムを用いて、NK細胞受容体の新しいリガンドを発見しました。例えば、ヘマグルチニンはNKp46のリガンドであり、PVLはTGのリガンドである。
