当社のプロトコルは、視聴者におけるがんの侵入を阻止する遺伝子または遺伝子の組み合わせを効率的に同定することを可能にします。培養を介してメンテナンスのための高度な動物施設を必要としません。全体として、一般的なライブラリまたは一般的な特別なライブラリは、ビューアで数週間の問題でスクリーニングすることができます。
このオーバースクリーニングシステムは、研究者が癌転移を遮断するために使用できる新しい治療遺伝子標的または遺伝子標的の組み合わせを発見するのに役立ちます。IV注射の場合、細胞を1ミリリットル当たり0.5〜100万個の細胞に濃縮し、氷冷1X PBSを使用して細胞を希釈または再懸濁する。10個の胚ごとに約1ミリリットルの細胞懸濁液が必要になると予想されます。
注射装置を組み立てるには、注射器に針を取り付け、長さ3~5センチのチューブで注射針を伸ばします。細かい鉗子を使用して、ホウケイ酸針の先端を破ります。50~200マイクロリットルの癌細胞懸濁液を注射器に積み込みます。
そして、ホウケイ酸塩の針をチューブに挿入します。針に細胞の詰まりや気泡がないか調べます。毛細血管内で細胞の詰まりが観察された場合は、毛細血管を取り除き、細胞を再中断して新しい毛細血管に置き換えます。
任意の気泡を押し出すためにプランジャーを使用してください。カバー蓋を外し、ステレオスコープの下で胚を移します。CAM表面に注入される適切な静脈を特定し、通常はホウケイ酸針先端の直径よりもわずかに広く、胚と計量皿壁の中間に位置する。
一般的に静脈分岐に隣接する点で注入する方が簡単です。針の先端を血管壁に押し付け、血流と同じ方向に穏やかな圧力をかける。必要に応じて、綿棒を使用して、注入される容器を固定または安定させます。
必要なボリュームが注入されるまで、シリンジプランジャーを2~10秒間静かに押し下げます。注射部位に過剰な出血や透明な液体の蓄積が現れた場合は、胚を捨てる。CAMから針を取り出し、綿棒で注射部位をそっと手を出して血液細胞または過剰な癌細胞を除去します。
注入した胚を計量皿に蓋をして蓋をし、インキュベーターに戻します。すべての胚が注入されるまで手順を繰り返します。細菌やカビの汚染や死の胚を視覚的に検査します。
そして、実験室の処分手順に従って汚染された胚を捨てる。転移性コロニーは、注射後の最初の1〜3日間の間に均一に見えるようにしてください。そして、4日目から5日目の注射後に侵襲的または非侵襲的な転移性コロニーを同定する。
5日目の注射後、インキュベーターから胚を取り除き、転移性コロニー分布のために胚のカラムを検査し、見つける。解剖顕微鏡の下で、目的の転移性コロニーを含むCAM組織を細かい鉗子を使用して上方に優しく引っ張り、外科用ハサミで切断する。CAM組織を空の無菌1.5ミリリットルチューブに移し、チューブ蓋を閉めます。
目的のすべてのコロニーが別々のチューブに収集されるまで切除手順を繰り返します。各コロニーに別々の滅菌18ゲージ針を使用して、マイクロ遠心分離管内のCAM組織を穏やかにミンチします。1XコラーゲンA溶液100マイクロリットルを加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。
周囲温度で5分間、細胞とCAM組織を300倍Gでスピンダウンします。コラーゲン-A溶液を吸引し、細胞の不完全な培地を再中断して、対象となる細胞株に対して用いることができる。その後、再び細胞と組織を回転させます。
完全な培地および選択因子の1ミリリットルで細胞および組織片を再中断する。その後、単一の12ウェル組織培養皿によく移します。今後1~3週間、がん細胞の増殖と汚染を毎日監視します。
細胞が70〜80%に達すると、より大きな体積培養皿にそれらを移す。適切ながん細胞数に達するとすぐに、シーケンシングまたは次の選択ラウンドに進みます。注射に失敗したために癌細胞の蓄積を示す胚は、毛細血管の大部分で見ることができる。
最適な細胞濃度と注射期間が達成されると、5日目の注射後トランスデューシング細胞は多種多様なコロニー表現型を産生し、癌細胞によって決定されるコロニーの大部分がCAM組織に散乱して現れる。注意は、コンパクトに見え、彼らは鉗子とはさみとCAM組織の一部で切除することができる近隣のコロニーから十分に離れて位置している転移性コロニーに支払われるべきです。分離された陽性スクリーンヒットは、再注入時にコンパクトコロニー表現型を表示する必要があります。
癌細胞血管接触の測定のために、注意は、血管壁の汚れの明るさに支払われるべきであり、レクチンの適切な量は、血管壁信号のために注入されるべきである。このプロトコルを試みるとき、注射の下または過剰を避け、過度の出血や液体の蓄積を除去します。この技術を用いて、視聴者におけるがん細胞の浸潤を促進しているいくつかの新しい遺伝子が同定されている。
