著者は、寛大に腫瘍材料を供給するための優れた技術支援と教授RuebbenのためJ. KueperとJ. Wittschierに感謝します。

すべての機器および試薬は、滅菌購入する必要がありますまたは熱または蒸気滅菌または70％エタノールで滅菌する必要があります。 動物実験は動物実験で定められている実験的な手続きと規制のための動物の管理と使用に関するNI​​Hのガイドラインに従って、欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に準拠して行われたという著者らの状態ケアとデュースブルク - エッセン大学（ドイツ）での委員会（IACUC）を使用してください。 パート1：卵のインキュベーション<ol><li>受精卵は、最大1週間までに13℃で保存することができます。 </li><li>卵は12回日連続して卵を回転させ、移動トレイ付きインキュベーターで水平に横たわって、72時間インキュベートする。湿度は60に保たれている - 62％、37.5でのインキュベーション℃の温度 注：インキュベーション、汚れ、羽や糞を開始する前に慎重にではなく、ソフト面の構造よりもラフを持っている共通の、灰色のジグザグのハンドペーパータオル、と乾いたワイピングによって機械的に卵の殻から削除されています。エタノールまたは消毒剤で卵を拭く、しかし、大幅に関係なく使用される液体の、胚の生存率を減少させた。 </li></ol>パート2： 例OVO文化<ol><li> 72時間のインキュベーション後、卵はインキュベーターから削除されます。 注 ：ための卵を72時間インキュベートされている-未知の理由のためですがアウエルバッハら1以前の開発段階と一致して有意に低い生存率を持っていた-私たちの実験によると。後72時間以上の段階ではまだCAMによってカバーされていない卵黄の袋は薄くなり、小さな遵守の領域における出血と卵黄袋の（ⅱ）破裂する（i）世界の主要卵の殻に付着する傾向が膜。したがって、提示方法は、72時間以上経過した胚には適用されません。 </li><li>胚は、ある程度回転に抵抗するので、胚が存在する卵の上面が、、鉛筆でマークされます。 </li><li>卵は上に鉛筆のマークで水平に保持し、卵の長軸に垂直に配向を敷設80ミリメートル三角マグネチックスターラーバーの端に割れている。 注 ：より良い感じでは、ない手袋を使用してはいけませんが、手は70％エタノールで消毒してください。卵の殻だけでなく、卵膜が開放されていることが重要です。卵白の漏出は、卵膜が穿孔されていることを安全なサインです。 </li><li>卵は卵白のさらなる漏れを避けるために、近くにペトリ皿の底部に保持されます。 注：初期のオープニングの手順の間に、ペトリ皿の底に卵白がまだ上部内側胚と卵黄を保持している卵の内側に真空中でこの結果として卵の内側部分に接続されていることが重要です。卵。真空は、どちらの卵への空気の流入を制御する指の圧力によって、または接続された卵白すなわち真空の列を増加させる卵を持ち上げることによって調節することができる。 </li><li>優しく親指と中指で卵の亀裂と赤道を通過する子午線に圧力を加えることによって、それは真空を安定化させることが可能です。卵黄と卵を静かに持ち上げているとシェルの両半分が慎重に区切られている場合は、卵の内容は、その後、無傷のペトリ皿に転送することができます。胚と卵黄の船が無傷の卵黄の上に横にしてください。 注 ：鉛筆のマークが上に保持されていない場合、シェルをクラッキングするときに、胚を傷つける可能性がある。卵は慎重に十分なひび割れや胚が（上記参照）72時間以上経過していない場合は、卵黄の袋には、シェルとしばしば破裂するスティック。インキュベーターの湿度が低く60％以上または卵が孵化時に回転していないときも同様です。 </li><li> EX卵培養はインキュベーターに戻し、37.5 ° 38.2 ° Cと60％の湿度で保管されています。インキュベーターが密閉されていない（換気のグリッド部分的にオープン！）と蓋と皿の間にスペーサーを持つ特殊ペトリ皿を使用する場合、CO 2やO 2の供給は必要ありません。 注 ：胚の移動は、インキュベーションの最初の日の間に最小限に抑える必要があります。高い死亡率にあまりにも多くの扇動の結果。インキュベーションの9日目以降は、胚は、攪拌の影響を受けにくくなります。 死亡胚は感染症を避けるために直ちに削除する必要があります。 細胞培養インキュベーターが使用されている場合は、密閉されている、O 2の供給が死ぬことではない胚のための必須です。 CAMが乾燥しないようにし、培養温度が37℃よりも低い場合、胚があまりにもゆっくりと進行するだろう。ために湿度が不可欠です。 </li></ol>パート3：血管新生アッセイのための物質の応用<ol><li>オートクレーブ折り畳んだろ紙（5直径0.5ミリメートルの）穴パンチャーで打ち抜き、CAMに適用される液体物質の材料（キャリア）をサポートとして使用されます。 注 ：それは発展途上CAM容器のアーキテクチャを変更したとして、ほぼ各担体材料は、（下記の表を参照）、培養10日目の前に適用される場合は特に、CAMの炎症を引き起こした。これはまた、潜在的に不活性なヒドロキシエチルセルロース箔のような物質が、テフロンのスポンジ（PTFE - pledgets）、コラーゲンスポンジ、コラーゲン箔、滅菌ガーゼ（綿棒）、すべての偽陽性の結果を引き起こした円形カバースリップ、およびシリコンのリングを、含まれています。ろ紙には、少なくとも刺激を引き起こすように見えたことで、我々のアッセイで使用されていました。 </li><li> CAMが完全に開発されている場合、最大6つの異なるサンプルを適用してもよいし、その効果は、単一のCAMで比較することができます。 </li><li>フィルタ追加投与（3μgのネイティブangiotropin）またはバッファ（5μlのPBS）、乾燥を避けるために、毎日再適用する必要があります。 </li><li>コントロールを周囲の血管のパターンが変更されていないのに対し、塗布後3日目から、血管は、フィルター上で血管新生物質に向けてオリエンテーション。 注：CAMは卵黄袋と間違えてはいけません。卵黄の袋は、開発時に少し分散を持つ静的でありながら、CAMは、動的な発展構造です。開発3日目の開発CAMは小胞と胚の尾方端で初めて認識することができる。 3日目一日10までの初期の小胞は、増加率で卵黄の袋をover​​growing折り畳まれた2層の膜を作成し、拡張します。アプリケーションのサイトでは、特に胚の透過光の効果の顕微鏡観察を妨げるような胚およびCAM（ボーダー）の倍の間に半分の方法でなければなりません。 CAMが増え続けて時あるいは、血管新生物質とフィルタが内在化されています。 </li></ol>第4部：CAMへの細胞への接種細胞の4.1.Preparation <ol><li>コンフルエントの細胞をピペットエイドを使用して滅菌25mlのプラスチックのピペットを使用することにより培養フラスコからファルコンチューブに移しています。 </li><li>細胞数を推定するために、細胞懸濁液の15μlをノイバウアー室に搬送され、細胞を顕微鏡下で手動でカウントされます。 </li><li>ファルコンチューブは、室温で1000rpmで3分間遠心分離し、上清は廃棄されます。 </li><li>メーカーのプロトコルに従って、および赤色蛍光生細胞の膜の標識キット、例えば、PKH26（Sigma社）で染色した：生細胞の追跡のために、細胞は、所望の濃度（2 × 10 7細胞/ mlここ）にPBSで希釈されています。 希望の注入のための濃度（10 7細胞/ ml）または接種（3 × 10 6セル/ ml）に、細胞は、細胞培養培地（DMEM優先的にダルベッコ改変イーグル培地）に再懸濁している。異なる細胞濃度は、すでに文献15から17と我々の経験に掲載された濃度に応じて注射対接種のために適用されます。 </li></ol> CAM上のセル4.2接種<ol><li>指輪（〜1mm厚）が鋭いメスを使用して1ミリリットルピペットチップまたは末梢静脈カテーテル（PVL）チューブから切断し、E6 - E14ニワトリ胚培養元のOVOのCAMに適用されます。 注 ：いくつかの回を&quot;見た&quot;ことではなく、ワンカットが生じるのリング上でシャープなエッジを避けるために、新しい、非常に鋭いメスを用いてピペットチップまたはカテーテルの管を通って切断しないようにしようマイクロクラックに起因する鋭いエッジのための顕微鏡の下のリングを確認してください。 </li><li>リングのサイズによっては3 × 10 6細胞/ mlの細胞20μlを一つの環にまたは複数のリングに分割ボリュームなど、合計でピペッティングしている。 注 ：場合によっては、穏やかなスクレイピングによるCAMのtraumatisationはセル17と移植片のcapillarisation（下記参照）の接種を促進するための前提条件、などです。しかし、CAMのtraumatisationが意図されていないか、または腫瘍細胞の浸潤能の研究のためなど、contraindicative、リングは接種のために使用すべきではないが、細胞がリングやリングの応用として直接適用されるかどうか自体がマイクロ病変を誘発するかもしれない。リングが使用されている場合、これらは重量を最小限に抑え、CAMのインデントを避けるために、できるだけ薄くカットしてください。 </li></ol>パート5：細胞の硝子体内注射<ol><li>ハミルトンマイクロリットルの注射器は滅菌PBSで最終的に70％エタノールとで数回リンスする。 </li><li>マイクロシリンジは、準備ステンドグラスや染色細胞懸濁液（パート4.1を参照）が充填されている。 注：注射部位を慎重に選ぶ必要がある、針で貫通以上で胚のCAMまたは隣接する構造物（brain!）の血管を傷つけるためではない。注入は、解剖の双眼で行う必要があります。 </li><li>顕微鏡の制御下、慎重に、しかし、すぐに注射針でCAMと目の層に浸透し、継続的にニワトリ胚培養元のOVOの硝子体に最大20μlの細胞懸濁液（優先的にPBSで希釈）に10を注入。 注：CAMを針で貫通することができない場合、それは静かにtwoピンセットでそれを離れて引き裂くことによりほとんどまたはまったく血管のあるサイトで削除されることがある。 </li><li>針は、漏れによって注入された細胞懸濁液の損失を避けるために、目の中に1〜2秒のままです。 </li></ol>パート6：ニワトリの肢芽の解剖<ol><li>卵はインキュベーターから削除されますインキュベーションの3〜4日後（E3/E4 =ハンバーガーハミルトン（HH）stage18 - 23） </li><li>卵は、三角形のマグネチックスターラーバーの端にひび割れやペトリ皿に移し、（詳細：パート2を参照）され、胚は、春のはさみを使って円をカットして接続されている卵黄の船から解剖される。 </li><li>胚は小さなドレインスプーンの使用によって冷たい、滅菌PBSで満たされた新鮮なペトリ皿に移し、親切な攪拌によって洗浄される。 </li><li>胚は、慎重に微細な鉗子でそれらを離れて引き裂く、滅菌PBSを充填し、周囲の膜から解放される小さなペトリ皿に移している。 </li><li>肢芽は、（移植の手順を参照してください）把握し、8、10日齢のホストニワトリ培養元のOVOのCAMに転送、なるべく身体の近くに顕微鉗子で切断されます。 </li></ol>パート7：マウス肢芽の準備<ol><li>時間妊娠交配が設定され、膣栓が女性の交配で検出される日の朝は、妊娠0日を指定されます。 </li><li>妊娠中の女性は、胚の発達は、（E）10 13に日胚に到達し、ワックスのボード上に固定されて頸椎脱臼により屠殺された。 </li><li>腹壁を正中線に沿って切断し、皮膚フラップはピンで横方向に固定され、70％エタノールで湿らされています。 </li><li>子宮の両方の角をデタッチし、冷PBSでビーカーに移し、腹部から削除されます。 </li><li>胚を分離し、ペトリ皿と子宮の壁に転送し、胚膜は鉗子を使用して慎重に除去されています。 </li><li>肢芽は、把握し、8、10日齢のホストニワトリ培養元のOVO（移植の手順を参照）のCAMに転送、春のはさみを使用することによって切断、あるいはできるだけ身体に近づけて細かい鉗子によって切り離されている。 </li></ol>パート8：腫瘍サンプルの収集<ol><li>腫瘍生検は、腫瘍細胞特異的培地（ここで：リーボビッツの培地）を充填した2ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに回収され、室温で保存。 </li><li>腫瘍生検は無菌のメスで1〜2立方ミリメートル片に切断されています。 注 ：腫瘍のサンプルが小さすぎていた場合、彼らはあまりにも大きかった場合、彼らは、CAMに接続されない場合があります、CAMが負傷する可能性があり、胚が死ぬかもしれない。 </li><li>生検標本のコアからの作品は、8、10日齢のホストニワトリ培養元のOVO（移植の手順を参照）のCAMに移植されています。 注 ：生検の表面から材料を取ることは筋肉や結合組織による汚染のリスクを増大させる。 </li></ol>パート9：グラフト手順<ol><li>肢芽や腫瘍試料のグラフトでは、8、10日齢のニワトリ胚の完全に開発されたCAM培養元のOVOが使用されます。 </li><li>移植片は、理想的に血管のY分岐近くCAM上に配置されています。 </li><li>目的のアプリケーションのサイトでは、CAMが選択的に基底層はそのまま残し、穏やかなスクレイピングのオフ（鉗子）二上皮層の上側の周皮の一部が傷つけている。 注 ：これは、出血や毛細血管の可視破裂を避けるために不可欠です。 </li><li>移植片は、接続されている最小限のPBSでCAMに転送されます。移植に応じて、それは移植は最後のが過度のPBSを除去することを意図しないし、最後に準備トラウマCAMサイトでグラフトさCAM、のサイトに一度か二度配置される場合があります。 </li><li>移植片は、微細な鉗子で把持し、CAM上に重層されています。移植片の感度に応じて、光の圧力は、CAM（腫瘍サンプルに適しています）の結果インデントに操作する（肢芽には適していません ）移植片に適用される場合があります。 注 ：ひよこ免疫システムは、胎生（E）18で発展するにつれ、ホストのニワトリ胚は、頻繁に死ぬように、 元OVO異種移植片の培養物は、E17を超えて延長されるべきではない。 それはあなたの選択のドナー組織のソースと一致するようにタイミングをそれぞれ利用可能なホストのCAMは、ニワトリ胚培養元のOVOを、持つことが重要です。 </li></ol>パート10：再移植<ol><li>ホストのニワトリ胚断頭により殺される。 </li><li>とCAM添付された移植片は、先の尖ったハサミを持つ円形の切断して除去し、PBSで満たしたペトリ皿に移している。 </li><li>過度のCAMは、かつての付着部位を除いて春のはさみによって移植片からカットされます。 </li><li>大きな腫瘍サンプルの場合には、移植片は半分またはいくつかの小さな断片に切断され、二番目のホストの新しいCAMが直面している最先端で再グラフト。 </li></ol>パート11：代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。シェルレスチキンの文化 異なる発展段階ペトリ皿で培養EX OVOのニワトリ胚。 <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 例OVO CAMの血管新生アッセイ 受精鶏卵を37で水平インキュベート60℃、湿度した - 62％、胚4日目（E4）でペトリ皿にひび。インキュベーションは、同じ条件で継続した。 E10滅菌濾紙（直径5.5 mm）でのCAMの上に階層化され、5μlのPBSまたはangiotropin6ネイティブ3μgのいずれかで浸漬。毛細血管は、E14でangiotropin浸したろ紙に向かって明らかなアライメントを示した。 <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。肢芽の移植例OVOは、 ひよこ（E3/E4）およびマウス（E13）から肢芽は、シェルのない鶏の文化のCAMに移植した。 CAMからの血管は、2日後に肢芽に入った。肢芽の開発は、ニワトリ二つ指骨の段階に到達し、マウス肢芽におけるインターウェブの削減を表示するこれらの元OVOの文化に続いた。 <img src="/files/ftp_upload/1620/1620fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。腫瘍サンプルの例卵接種 膀胱癌の生検標本は、10日齢のニワトリ胚培養元のOVOのCAMに接種した。培養中の2日後、腫瘍検体はCAMの血管に接続され、7日後、移植片を入力する複数の血管が観察された。

<ol>
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Res. 20, 237-239 (1992).</li><li>Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+generates+a+more+invasive+phenotype+of+tumour+cells:+an+in+vivo+experimental+setup+based+on+the+chorioallantoic+membrane.">Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane.</a> Pathol. Oncol. Res. , (2008).</li><li>Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. 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革新的なまたは単に別のひよこの文化のプロトコル？ 旧シェルレス文化プロトコルでニワトリ胚1-4総生存率は、例えば約低かった。 30パーセント1。このビデオの記事で説明されている洗練された元OVO文化のプロトコルは、対照的に、50％以上の生存率が可能になります。ニワトリ胚の卵文化の古典的な元OVO培養物と比較して大?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fertilized Eggs</td>
<td>Animal</td>
<td>S&ouml;ries Trockels, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Incubator Type 3000 with rotating egg tray</td>
<td>Tools</td>
<td>Siepmann GmbH Germany</td>
<td>9503</td>
<td>Maintain at 37&deg;C with relative humidity set above 60%</td>
</tr>
<tr>
<td>Egg incubator BSS 160</td>
<td>Tools</td>
<td>Grumbach, Germany</td>
<td>8101</td>
<td>Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile
</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco's modified eagle's medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 6429</td>
<td>DMEM culture medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Leibovitz's L-15 Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>31415-029</td>
<td>here: collection medium for tumor samples</td>
</tr>
<tr>
<td>Tumor cell -specific medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz's Medium or Dulbecco's modified eagle's medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 &mu;M insulin</td>
</tr>
<tr>
<td>70% EtOH</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic stir bar, triangled 80 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>442-0391</td>
<td>A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5 </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors, straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Fine Iris scissors, straight</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14094-11</td>
<td>Use to cut our the CAM</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>microliter syringe 1702 TLLX, 25 &mu;l</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton</td>
<td>80222</td>
<td>Use for injection into the vitreous</td>
</tr>
<tr>
<td>Hamilton 33-G needle (15 mm)</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>18073-15</td>
<td>Use for injection into the vitreous</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterile scalpels</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use for dissecting tumor samples</td>
</tr>
<tr>
<td>Small drain spoon</td>
<td>Tool</td>
<td>Geuder, Germany</td>
<td>15758</td>
<td>Use to transfer of small chick embryos</td>
</tr>
<tr>
<td>Wax board with fixing pins</td>
<td>Tool</td>
<td>Self made</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to fix of animals for dissection</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dishes 60 x 15 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Greiner</td>
<td>628102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petri dishes 92 x 16 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>82.1472</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Petri dish 100 x 20 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Greiner</td>
<td>664160</td>
<td>extra deep, with spacers for ventilation</td>
</tr>
<tr>
<td>Beaker</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>300-600 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>FALCON tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>15 ml and 50 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1.5 ml and 2 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml pipette tips</td>
<td>Tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to cut plastic rings for application of substances / cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Peripheral venous catheter (PVL)</td>
<td>Tool</td>
<td>Viggo&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipettes and tips</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf / Abimed</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter</td>
<td>Tool</td>
<td>Schleicher &amp; Schuell</td>
<td>311643</td>
<td>Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper</td>
</tr>
<tr>
<td>PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>santec-medical</td>
<td>REF 277, LOT 832/511-1</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000</td>
<td>Reagent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Kollidon 17 PF</td>
<td>Reagent</td>
<td>BASF</td>
<td>S30200</td>
<td>mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagen Biomatrix TissuDura</td>
<td>Tool</td>
<td>Baxter Healthcare S.A.</td>
<td>REF B2246000999999</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Round glass cover slips, 11 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Assistent Germany</td>
<td>1001/0011</td>
<td>Carrier; causes false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine Collagen Sponge</td>
<td>Tool</td>
<td>Wyeth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Resodont Absorbable Collagen Membrane</td>
<td>Tool</td>
<td>Resorba Woundcare Germany</td>
<td>LOT 280303</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-Woven Swabs</td>
<td>Tool</td>
<td>Fink &amp; Walter GmbH</td>
<td>REF 328132</td>
<td>Carrier; caused false positive results</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

chick ex ovo culture and ex ovo cam assay: how it really works

繁殖の初期段階での鶏の卵は、in vitroおよび in vivo の系での間にあると血管新生を研究するだけでなく、腫瘍形成を研究するだけでなく、血管のテスト環境を提供しています。ニワトリ漿尿膜（CAM）が開発された後、その血管のネットワークを簡単に、アクセス操作や観察、したがって、血管新生アッセイの最適な設定を提供することができます。リンパ系が完全にインキュベーションの後期段階まで開発されていないので、ニワトリ胚では、種特異的制限なしに移植された組織や細胞を維持できる自然に免疫不全宿主の役割を果たします。同種および異種移植の開発育成に加えて、CAMの血管のネットワークは、腫瘍細胞の脈管内へ、普及、および血管の逮捕と逮捕の細胞はミクロ転移巣を形成するために浸出リポジトリの一意な環境を提供します。 実験的な目的のために、CAMが卵の殻と実験により、ウィンドウを切断することによって露出された最近の研究のほとんどに効果の観察と写真ドキュメンテーションのためのCAMとの可能性のアクセシビリティの重要な制限の結果、OVOで実施された。ニワトリ胚の殻のない文化が1-4を使用した場合に、実験的な詳細はまったく公開されている場合は、提供されないとされ、これらの培養物の生存率は低かった。私たちは、卵のコンテンツの合理的制御押し出しを導入することにより、大幅にニワトリ胚の元OVO文化の方法を精緻化。これらの元OVOの文化は、効果のin vivoでのドキュメントに簡単に有効化および胚の実験的操作を容易に、CAMおよびニワトリ胚のアクセシビリティを向上させる。ニワトリ胚の眼7-9の硝子体に容易に注射のために設定（1）改良された血管新生アッセイ5,6として、（2）実験、（3）：これは、科学的な質問の多数に成功したアプリケーションを可能に成功した移植と文化鶏肉やマウス13の肢芽のほか、（5のための改善、持続性のあるシステムとしてCAM 10-12接種樹立した細胞株から分散した腫瘍細胞、（4）の普及と管内のためのテスト環境として）、伝播を移植し、カム14の表面上に生検から得られた固形原発腫瘍組織の再移植のための。 このビデオの記事では、洗練されたひよこの元OVO文化と50％以上の生存率とCAMアッセイの確立について説明します。加えて我々は科学的な多数のアプリケーションのための元OVO文化の成功したアプリケーションのステップのデモンストレーションで手順を提供します。 ダニエルS. Dohle、スザンヌD.パシャ、とセバスチャンGustmannはこの研究にも同様に貢献した。

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Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

ニワトリ漿尿膜（CAM）は、血管新生と腫瘍形成を研究するユニークな、自然に免疫不全支える文化環境です。このビデオの記事では、ニワトリの異なるステップを示しています<em&gt; EX卵</em&gt;文化、潜在的に血管新生物質の応用とCAMの表面上の腫瘍細胞や組織の成功を接種。

チック EX卵文化と EX卵 CAMアッセイ：それが実際にどのように動く

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

48.5K ビュー.  University of Duisburg-Essen. ニワトリ漿尿膜（CAM）は、血管新生と腫瘍形成を研究するユニークな、自然に免疫不全支える文化環境です。このビデオの記事では、ニワトリの異なるステップを示しています EX卵文化、潜在的に血管新生物質の応用とCAMの表面上の腫瘍細胞や組織の成功を接種。

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In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HHステージ10ニワトリ胚のOVOエレクトロポレーションで

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

生物学

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

アン EX - OVO</emイメージングとマイクロサーアプリケーションに適して>ニワトリ胚培養システム

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and uterine carcinomas, where death rates have fallen in recent years, ovarian cancer cure rates have remained relatively unchanged over the past two decades 1. This is largely due to the lack of appropriate screening tools for detection of early stage disease where surgery and chemotherapy are most effective 2, 3. As a result, most patients present with advanced stage disease and diffuse abdominal involvement. This is further complicated by the fact that ovarian cancer is a heterogeneous disease with multiple histologic subtypes 4, 5. Serous ovarian carcinoma (SOC) is the most common and aggressive subtype and the form most often associated with mutations in the BRCA genes. Current experimental models in this field involve the use of cancer cell lines and mouse models to better understand the initiating genetic events and pathogenesis of disease 6, 7. Recently, the fallopian tube has emerged as a novel site for the origin of SOC, with the fallopian tube (FT) secretory epithelial cell (FTSEC) as the proposed cell of origin 8, 9. There are currently no cell lines or culture systems available to study the FT epithelium or the FTSEC. Here we describe a novel ex vivo culture system where primary human FT epithelial cells are cultured in a manner that preserves their architecture, polarity, immunophenotype, and response to physiologic and genotoxic stressors. This ex vivo model provides a useful tool for the study of SOC, allowing a better understanding of how tumors can arise from this tissue, and the mechanisms involved in tumor initiation and progression.

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

The fallopian tube (FT) is emerging as an alternative site of origin for serous ovarian carcinoma (SOC). This protocol describes a novel method for the isolation and ex vivo culture of fallopian tube epithelial cells. This system recapitulates the in vivo epithelium and allows the study of SOC pathogenesis.

初代ヒト卵管上皮細胞のex vivoでの文化

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

ニワトリ胚の網膜におけるOVOエレクトロポレーションに

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

して、古いニワトリ胚への遺伝子導入<em&gt; EX OVO</em&gt;エレクトロポレーション

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.