卵巣組織移植を研究するためのツールとしてのひよこ絨毛膜(CAM)モデル

卵巣組織移植後の早期変化を観察するためのCAMの使用は、早期の血管新生と卵胞喪失プロセスに影響を与えるメカニズムの調査を可能にするため、in vitroモデルよりも大きな利点があります。この技術は安価であり、最初の17日間は自然胚免疫不全症による移植片拒絶反応のリスクなしに実施することができる。さらに、このアプローチは、欧州法の観点から倫理的または法的懸念を引き起こしません。

卵子操作に必要な手技を身につけるための最良の戦略は、実際の実験の前に非胚卵子で訓練することによって達成されるかもしれません。まず、マーカーを使用して、Louvainから選択した白いレグホーンの雛から受け取った卵がゼロの日にラベルを付けます。摂氏37度に設定されたインキュベーターで、先のとがった端を下に向けて卵を孵化させます。

卵を180度回転させ、手動で1日2〜3回回転させます。暗闇の中で、卵の殻にエッグキャンドラーを置き、マーカーを使用して卵の殻のエアポケットの中心をピンポイントで特定します。ライトを点灯し、マークされた位置で滅菌ストレートピンを回転させて、約1ミリメートルの開口部を作ります。

エッグキャンドラーを使用して、暗闇の中で卵黄袋を見つけます。卵黄袋を壊すことなく、卵の底に向かって45度の角度で滅菌された19ゲージの針で卵に穴を開けます。1.5〜2ミリリットルのアルブミンを吸引して、CAMをシェルから剥離します。

次に、粘着テープで穴を塞ぎます。明かりをつけて、水平に置いた卵の上に1×1.5センチの長方形の窓を描きます。卵を片手で持ち、殻を割らずにスクロールソーの刃を使用して卵の殻に窓をそっと切り込みます。

定期的に吹き飛ばして、シェルのほこりや破片を取り除きます。滅菌鉗子を長方形のシェルの下にスライドさせ、CAMを損傷することなくきれいに取り外します。次に、白い外殻膜を捨てて、胚とCAMを確認します。

生存可能な胚卵では、ニワトリ胚発生の3日目に、透明なアルブミン、胚の周りの血管リング、および時には心臓の鼓動が見られます。層流フードの下で、窓を上にして卵を卵ラックに置き、テープをはがします。1センチメートル四方の滅菌エーテル抽出レンズペーパーを上皮表面にそっと置き、すぐに取り除き、CAMの小さな領域に外傷を与えます。

次に、凍結融解した卵巣皮質ストリップをマイクロサージェリー鉗子でつかみ、髄様側をCAMに対して外傷性CAMに置きます。デジタル写真やビデオを撮影する前に、移植片を肉眼的に評価し、移植片に対するCAMの血管反応に特に注意を払ってください。完了したら、鉗子で組織または周囲のCAMをつかみ、ハサミを使用してCAMから移植片を慎重に切除して、移植片を採取します。

移植片は、移植の初日後の症例の100%で実行可能でした。彼らはすでにCAMに部分的に接着しており、血管新生に必要な血管のホイールスポークパターンを示しました。6日間の移植後、インプラントをCAMに接着しました。

移植後3日目頃、移植片はCAMの2番目の層で覆われ、カプセル化されました。移植片は良好な血管新生を示し、移植の80%が卵子を貫通しました。2つの移植片はCAMに付着せず、壊死した外観を呈し、6日後の移植組織生存率は83%でした。

移植の組織学的評価では、健康な卵胞がすべての時点で観察されました。移植後、卵胞密度のわずかな減少が観察されました。卵胞の生存率は、移植期間中、1日目に95%、6日目に83%に維持されました。

最も難しいのは、アルブミンを吸引し、卵殻からCAMを剥がすのに必要な小さな穴を開けてから、窓を開けることです。圧力が高すぎると、過度の刺激が発生したり、卵子にひびが入って破壊されたりして、CAMやその血管系に取り返しのつかない損傷を与える可能性があります。このモデルは、血管新生促進因子、保護抗酸化剤、サイトカイン、ホルモン、および卵胞の活性化と初期成長を制御するその他の因子の影響など、移植後の初期卵巣組織のいくつかの側面をテストするのに理想的です。

このモデルは、卵巣組織移植後に卵巣予備能の低下をもたらす2つの主要なイベントである早期血管新生と卵胞活性化の調節との関連を示しました。