このプロトコールでは、制限エンドヌクレアーゼによる部位特異的なDNA切断を1分子レベルで直接観察することができます。私たちのマルチプレックスアプローチにより、何百もの個々のREaseが触媒サイクルを完了するのにかかる時間を測定することができます。マルチプレックス化により、切断までの十分な滞留時間を生成することができ、それをガンマ確率分布に適合させてDNA切断のメカニズムに関する洞察を得ることができます。
まず、50 μLのオリゴヌクレオチドと50 μLの新たに調製したDTT溶液で各チューブに再懸濁したオリゴヌクレオチド用の新しいチューブを調製し、ピペットで上下に動かして混合し、室温で30分間インキュベートします。各サンプル混合物の全容量を調製したカラムに静かにピペットで移動し、750Gで2分間遠心分離します。遠心分離後、すぐに使用しないサンプルは、チオール基の酸化やジスルフィド結合の形成を防ぐために、摂氏20度で保存してください。
50マイクロリットルの量子ドットストックの1アリコートを、作るコンストラクトごとに透析装置にピペットで入れ、ピペットの先端でメンブレンに触れないように注意してください。サンプル量の少なくとも1, 000倍であるCHES緩衝液の量に対して、100RPMで15分間攪拌して透析します。ピペッターを使用して、懸濁した量子ドットを透析装置から慎重に取り出し、等量の新しく調製したSulfo-SMCC溶液を含む新しいチューブに移し、ピペッティングで上下に動かして混合します。
1, 000 RPMで振とうしながら室温で1時間インキュベートし、Sulfo-SMCCが量子ドット上の第一級アミンと反応できるようにします。次に、ピペッターを使用して、各サンプルを新鮮な透析装置に慎重に移します。過剰なスルホ-SMCCを除去するには、透析装置に含まれる容量の少なくとも1, 000倍のCHES緩衝液に対して、15分間攪拌しながら透析します。
バッファーを2回交換し、新しいCHESバッファーで合計3回透析を行い、各バッファー交換後15分間透析を進行させます。その後、PBSで透析を繰り返します。ピペッターを使用して、透析装置から量子ドットを含む溶液を慎重に回収し、各サンプルをPBSで希釈した等モル量の拡張オリゴヌクレオチドを含む新しいチューブに移します。
1, 000 RPMで振とうしながら室温で2時間インキュベートします。各サンプルにBSAを添加して、最終濃度を0.5ミリグラム/ミリリットルにします。次に、ピペッターを使用して各サンプルを新しい透析装置に慎重に移し、保存バッファーに対して透析します。
透析後、各サンプルを慎重に回収し、新しいチューブに入れます。サンプルは摂氏4度で保存します。量子ドット標識オリゴヌクレオチドのサンプルを、10倍モル過剰のビオチン化オリゴヌクレオチドと組み合わせます。
ヒートブロック内の混合物を摂氏75度に加熱し、その温度で5分間保持します。次に、ヒートブロックをオフにし、混合物をゆっくりと冷まします。完成したコンストラクトを摂氏4度で保管します テーパーダイヤモンドポイントホイールビットが取り付けられたハンドヘルドロータリーマルチツールを使用して、クォーツスライドの反対側のコーナーに2つの穴を開けて、入口と出口として機能します。
スライドを所定の位置に固定し、ビットに注油し、穴を開けながら常に水でスライドしてください。各実験の後、使用したデバイスをアセトンに浸して接着剤とエポキシを溶解することにより、準備した石英スライドを回収します。残りのコンポーネントは廃棄します。
25マイクロリットルのストレプトアビジン溶液を80マイクロリットルのPBSおよび20マイクロリットルのブロッキングバッファーと組み合わせます。PEG処理したカバースリップにこの混合物をコーティングし、湿度の高い環境で30分間インキュベートします。カバースリップのインキュベーション中に、イメージングスペーサーを準備して流路を作成します。
1インチ四方のイメージングスペーサー材料をカットし、クォーツスライドに開けられた穴の端に位置合わせして幅2ミリメートルのチャネルに印を付けます。メスでスペーサー素材からチャネルを切り取ります。クォーツスライドをアセトンで完全に洗浄し、以前の実験で残った接着剤を取り除きます。
イメージスペーサーの裏地の片側をはがし、入口と出口の穴を覆わないように注意しながら、クォーツスライドに慎重に置きます。カバースリップを水で洗い、圧縮空気で乾かします。イメージングスペーサーから裏地の反対側を取り外し、プラスチックピンセットを使用してクォーツスライドと官能基性ストレプトアビジンコーティングカバースリップの間に挟み込み、アセンブリを一緒に押し付けて接着剤から気泡を取り除きます。
チューブの端を斜めに切断して、溶液が自由に流れるようにします。次に、長さ30センチメートルのポリエチレンチューブをクォーツスライドの各穴に挿入します。チューブをチューブラックで所定の位置に保持し、エポキシを使用してチューブを所定の位置にシールし、組み立てたデバイスの端をシールします。
エポキシ樹脂をセットしたら、空のシリンジに鈍い針をデバイスの出口チューブに挿入し、入口チューブの端をブロッキングバッファーで満たされた容器に浸します。.シリンジプランジャーを引き戻して、デバイスにブロッキングバッファーを充填します。その後、使用前に少なくとも30分間デバイスをインキュベートします。
マイクロ流体デバイスを顕微鏡ステージプレートにテープで取り付けます。対物レンズをデバイスの底部に接触させ、視野がマイクロ流体チャネル内に収まるように対物レンズを配置します。アウトレットチューブをシリンジポンプに接続した後、シリンジプランジャーを引き戻して、マイクロ流体チャネルを新しいブロッキングバッファーで洗い流します。
チューブやチャネルに気泡が溜まっていないことを確認してください。調製したDNA基質1マイクロリットルを1ミリリットルのブロッキングバッファーに希釈します。インレットチューブを希釈したDNA基質に入れ、800マイクロリットルの基質溶液をチャネルに毎分200マイクロリットルの速度で流します。
DNA溶液をチャネル内でインキュベートし、流れが止まった後15分間待ちます。インキュベーション後、少なくとも800マイクロリットルのブロッキングバッファーを毎分200マイクロリットルの速度でチャネルに流し、結合していないDNAをチャネルから洗い流します。表面につながれた量子ドットがはっきりと見えるように顕微鏡の焦点を調整します。
マイクロ流体デバイスをマグネシウムを含まない800マイクロリットルの実験用バッファーで毎分200マイクロリットルの流量で洗い流します。マグネシウムを含まない実験用バッファーのアリコートにREaseを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。EcoRVのミリリットルあたり400ユニットの800マイクロリットルを毎分200マイクロリットルの流量でチャネルに流します。
マグネシウムとフルオレセインを含む実験用緩衝液を毎分200マイクロリットルの流量で流すことから実験を開始します。シリンジポンプを始動した直後にデータのキャプチャを開始します。800マイクロリットルのバッファーを流した後、データ取得を停止します。
DNA基質をフローセルに導入し、余分なDNAと量子ドットを洗い流した後、通常、視野内には数千の個々の量子ドットがあります。それらはガラス表面に安定して取り付けられており、実験全体を通して目立った調光や大幅な漂白を受けません。マグネシウムが存在しない状態でREaseがチャネルを流れた場合、実験の開始時に存在していた量子ドットの少なくとも95%は、観測期間の終了時にも見ることができます。
しかし、REaseの直後にマグネシウム含有バッファーを流すと、REaseとマグネシウムを一緒にチャネルに流した場合と同様に、観測期間の終わりまでに最大で量子ドットが消失します。量子ドットの消失は迅速に起こり、強度の軌跡が急激に減少するため、特定のDNA分子が切断される時間を明確に示します。この実験は、よく研究されているタイプII P REase EcoRVで行われました。
非線形最小二乗曲線フィッティングと最尤パラメータ推定の両方を使用して、データからnとbetaの値を抽出しました。2つのパラメータ推定方法は一致していました。非線形最小二乗近似を使用すると、n は 3.52 秒、ベータは 5.78 秒でした。
最尤推定を使用すると、n は 3.41 秒、ベータは 6.06 秒でした。このアッセイは、切断経路に沿った中間ステップの存在の証拠を提供することができます。変化する反応条件下でこのアッセイを実施することで、直接観察できない反応中間体の性質を確立するのに役立ちます。
