С помощью этого протокола мы можем непосредственно наблюдать расщепление сайт-специфической ДНК эндонуклеазами рестрикции на уровне одной молекулы. Наш мультиплексный подход позволяет нам измерять время, необходимое сотням отдельных REases для завершения каталитического цикла. Мультиплексирование позволяет нам генерировать хорошо заполненные распределения времени задержки до расщепления, которые мы можем сопоставить с гамма-распределением вероятностей, чтобы получить представление о механизме расщепления ДНК.
Начните с подготовки свежей пробирки для каждого ресуспендированного олигонуклеотида из расчета 50 микролитров олигонуклеотида и 50 микролитров свежеприготовленного раствора DTT на каждую пробирку, пипеткой вверх и вниз перемешайте и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Аккуратно нанесите пипеткой весь объем каждой смеси образцов на подготовленную колонку и центрифугируйте при температуре 750G в течение двух минут. После центрифугирования храните все образцы, которые не будут использоваться немедленно, при температуре 20 градусов Цельсия, чтобы предотвратить окисление тиоловых групп и образование дисульфидных связей.
Внесите одну аликвоту из 50 микролитров квантовых точек в диализное устройство для каждой изготовленной конструкции, следя за тем, чтобы не касаться мембраны кончиком пипетки. Диализ проводится при объеме буфера CHES, который по меньшей мере в 1000 раз превышает объем образца, при перемешивании при 100 об/мин в течение 15 минут. С помощью пипетки осторожно извлеките взвешенные квантовые точки из диализного аппарата и перенесите их в свежую пробирку, содержащую равный объем свежеприготовленного раствора Sulfo-SMCC, пипетируя вверх и вниз для смешивания.
Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре с встряхиванием при 1000 об/мин, чтобы позволить Sulfo-SMCC вступить в реакцию с первичными аминами на квантовых точках. Затем с помощью дозатора осторожно перенесите каждый образец в свежий аппарат для диализа. Для удаления избытка Sulfo-SMCC проводят диализ по объему буфера CHES, который по меньшей мере в 1000 раз превышает объем, содержащийся в диализном устройстве, с перемешиванием в течение 15 минут.
Замените буфер дважды и проведите диализ со свежим буфером CHES в общей сложности три раза, позволяя диализу продолжаться в течение 15 минут после каждой замены буфера. Затем повторите диализ с PBS. С помощью пипетки осторожно извлеките раствор, содержащий квантовые точки, из диализного устройства и перенесите каждый образец в свежую пробирку, содержащую эквимолярное количество расширенного олигонуклеотида, разведенного в PBS.
Выдерживать в течение 2 часов при комнатной температуре с встряхиванием при 1 000 об/мин. Добавьте БСА в каждый образец до конечной концентрации 0,5 миллиграмма на миллилитр. Затем с помощью дозатора осторожно перенесите каждый образец в новое устройство для диализа и поместите его в буфер для хранения.
После диализа тщательно извлеките каждый образец и поместите его в новую пробирку. Храните образцы при температуре 4 градуса Цельсия. Объедините образец олигонуклеотидов, меченных квантовыми точками, с десятикратным молярным избытком биотинилированного олигонуклеотида.
Нагрейте смесь в термоблоке до 75 градусов Цельсия и подержите ее при этой температуре в течение 5 минут. Затем выключите нагревательный блок и дайте смеси медленно остыть. Храните готовую конструкцию при температуре 4 градуса Цельсия С помощью ручного вращающегося мультитула, оснащенного коническим алмазным наконечником, просверлите два отверстия в противоположных углах кварцевого предметного стекла, которые будут служить входом и выходом.
Обязательно закрепите суппорт на месте, смажьте сверло и постоянно скользите водой во время бурения. После каждого эксперимента восстанавливайте подготовленное кварцевое стекло, замачивая используемое устройство в ацетоне для растворения клея и эпоксидной смолы. Выбросьте оставшиеся компоненты.
Соедините 25 микролитров раствора стрептавидина с 80 микролитрами PBS и 20 микролитрами блокирующего буфера. Покройте этой смесью покрытие, обработанное ПЭГ, и выдерживайте во влажной среде в течение 30 минут. Во время инкубации покровного стекла подготовьте прокладку для формирования проточного канала.
Отрежьте квадратный кусок размером 1 дюйм из материала распорки изображения, затем отметьте канал шириной 2 миллиметра, выровненный по концам отверстий, просверленных в кварцевом предметном стекле. Вырежьте канал из материала распорки с помощью скальпеля. Тщательно очистите кварцевое предметное стекло ацетоном, чтобы удалить остатки клея от предыдущих экспериментов.
Снимите одну сторону подложки с распорки изображения и осторожно поместите ее на кварцевое стекло, стараясь не закрывать входные и выходные отверстия. Промойте чехол в воде и высушите сжатым воздухом. Снимите другую сторону подложки с распорки для визуализации и поместите ее между кварцевым предметным стеколом и функционализированным покрытием со стрептавидиновым покрытием с помощью пластикового пинцета, чтобы прижать сборку друг к другу и удалить пузырьки воздуха из клея.
Отрежьте конец трубки под углом, чтобы обеспечить свободное поступление раствора. Затем вставьте полиэтиленовую трубку длиной 30 сантиметров в каждое отверстие в кварцевом предметном стекле. Удерживайте трубки на месте с помощью штатива для трубок, затем используйте эпоксидную смолу, чтобы запечатать трубки на месте и по краям собранного устройства.
После того, как эпоксидная смола будет закреплена, вставьте тупую иглу на пустом шприце в выпускную трубку устройства и погрузите конец входной трубки в емкость, заполненную блокирующим буфером. Потяните поршень шприца назад, чтобы заполнить устройство блокирующим буфером. Затем оставьте устройство для инкубации не менее чем на 30 минут перед использованием.
Прикрепите микрофлюидное устройство к пластине предметного столика микроскопа с помощью скотча. Соприкоснитесь объективом с нижней частью устройства и расположите объектив так, чтобы поле зрения находилось в микрофлюидном канале. После подключения выпускной трубки к шприцевому насосу промойте микрофлюидный канал свежим блокирующим буфером, оттянув поршень шприца назад.
Убедитесь, что в трубке или в канале нет пузырьков. Разведите 1 микролитр приготовленного субстрата ДНК в 1 миллилитр блокирующего буфера. Поместите входную трубку в разбавленный субстрат ДНК и пропустите через канал 800 микролитров раствора субстрата со скоростью 200 микролитров в минуту.
Дайте раствору ДНК инкубироваться в канале в течение 15 минут после остановки потока. После инкубации пропустите через канал не менее 800 микролитров блокирующего буфера со скоростью 200 микролитров в минуту, чтобы вымыть несвязанную ДНК из канала. Отрегулируйте фокус микроскопа так, чтобы квантовые точки, привязанные к поверхности, были хорошо видны.
Промойте микрофлюидное устройство 800 микролитрами экспериментального буфера без магния со скоростью потока 200 микролитров в минуту. Добавьте REase в аликвоту экспериментального буфера без магния и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Подайте 800 микролитров из 400 единиц на миллилитр EcoRV через канал со скоростью потока 200 микролитров в минуту.
Начните эксперимент с подачи экспериментального буфера, содержащего магний и флуоресцеин, со скоростью потока 200 микролитров в минуту. Начните сбор данных сразу после запуска шприцевого насоса. Остановка сбора данных после протекания 800 микролитров буфера.
После введения субстрата ДНК в проточную ячейку и вымывания избытка ДНК и квантовых точек, в поле зрения, как правило, оказываются тысячи отдельных квантовых точек. Они устойчиво крепятся к поверхности стекла и не подвергаются заметному затемнению или значительному отбеливанию на протяжении всего эксперимента. Когда REase протекает по каналу в отсутствие магния, по крайней мере 95% квантовых точек, присутствующих в начале эксперимента, все еще можно увидеть в конце периода наблюдения.
Однако, когда магнийсодержащий буфер протекает сразу после REase, до половины квантовых точек исчезает к концу периода наблюдения, подобно тому, как это наблюдается при совместном прохождении REase и магния через канал. Исчезновение квантовых точек происходит быстро и приводит к резкому снижению траектории интенсивности, что дает четкое представление о времени расщепления данной молекулы ДНК. Этот эксперимент был проведен с хорошо изученной P REase типа II EcoRV.
Для извлечения значений n и бета из данных использовались как нелинейная аппроксимация кривой методом наименьших квадратов, так и оценка параметра максимального правдоподобия. Эти два метода оценки параметров согласуются друг с другом. Используя нелинейную аппроксимацию по методу наименьших квадратов, n было равно 3,52, а бета — 5,78 секунды.
Используя оценку максимального правдоподобия, n было равно 3,41, а бета — 6,06 секунды. Этот анализ может предоставить доказательства наличия промежуточных этапов вдоль пути спайности. Проведение этого анализа в изменяющихся условиях реакции может помочь установить природу промежуточных продуктов реакции, которые не могут быть непосредственно наблюдаемы.
