このプロトコルは、細胞質、核、ミトコンドリア、および膜の4つの細胞コンパートメントを互いに分離する方法を提供するため、重要です。それだけでなく、信頼できる結果が得られるスケーラブルで再現可能な手順です。この技術の主な利点は、洗剤の使用を最小限に抑えて4つの細胞コンパートメントを分離できることであり、これにより、はるかに再現性が高く信頼性の高い分画手順が可能になります。
細胞質タンパク質を単離するには、RPMI 1640中のU937細胞を摂氏37度のウシ胎児血清と5%二酸化炭素で増殖させ、最終的に合計6 x 10から8番目の細胞に増殖させます。培養物を遠心分離し、細胞ペレットを室温PBSに再懸濁して、1ミリリットル当たり4×10の最終濃度まで6細胞、穏やかにピペッティングして凝集塊を分割する。2回目の遠心分離の後、ペレットを1ミリリットル当たり10個ずつ7個目の細胞で終濃度の氷冷溶解緩衝液Aに再懸濁する。
下流の核タンパク質抽出のために7.5ミリリットルの細胞を氷上の円錐形のチューブに加え、遠心分離によって残りの細胞をペレット化します。ペレットを細胞質単離バッファーに最終濃度2 x 10で7番目の細胞/ミリリットルに再懸濁し、穏やかにピペッティングして塊を分解してから、細胞を摂氏4度で20分間インキュベートし、エンドオーバーエンド回転させます。インキュベーションの最後に、細胞懸濁液を遠心分離し、上清をきれいな遠沈管に移します。
上清を遠心分離して細胞残渣を沈降させる。遠心分離後、上清を新しい遠沈管に移し、ペレットが観察されなくなるまで遠心分離シーケンスを繰り返します。サンプルに破片がなくなったら、細胞質ゾル画分を含む上清を摂氏4度で最大1か月間保管します。
次いで、保存した細胞ペレットを溶解緩衝液Aに、1ミリリットル当たり6個ずつ4個ずつ10個の最終濃度まで再懸濁する。細胞ホモジナイゼーションのために、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して、過剰なジギトニンおよび収縮期汚染物質を除去します。ペレットを氷冷セルホモジナイゼーションバッファーに最終濃度4×10で再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。
一方、ビーズベースの機械的溶解の場合は、氷上で50ミリリットルのスカート付きチューブ内の15ミリリットルの溶解バッファーBに、30グラムの事前に洗浄したステンレス鋼3.2ミリメートルビーズを加えて冷却します。インキュベーションの最後に、スカートチューブ内のバッファーを細胞懸濁液と交換し、細胞を速度8で5分間ブレンドします。溶解後、ホモジネートをきれいなチューブに移します。
ホモジネートを遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。サンプルから残っている破片を取り除くには、示されているようにホモジネートを3回遠心分離し、各遠心分離後に上清を新しいチューブに移します。最後の遠心分離の後、粗ミトコンドリア画分を単離するために、上清を遠心分離用の新しいチューブに移す。
遠心分離後、上清を新しいチューブに移し、粗ミトコンドリア画分含有ペレットを氷上に置きます。膜画分を単離するには、回収した上清を遠心分離し、上清を捨てた後、粗膜画分含有ペレットを氷上に置く。等密度勾配精製のために、粗ミトコンドリアおよび膜画分ペレットを200マイクロリットルの溶解バッファーBおよび1.8ミリリットルのヨージキサノールに再懸濁します。
各サンプルの不連続ヨージキサノール勾配を作成するには、まず、サンプルごとに1つの8ミリリットルのオープントップの薄肉超遠心チューブの底に1ミリリットルの15%ヨージキサノールを追加します。次に、各チューブの15%ヨージキサノール層の下に、20%ヨージキサノール1ミリリットル、25%ヨージキサノール1ミリリットル、30%ヨージキサノール1ミリリットル、35%ヨージキサノール1ミリリットルを順次下敷きにする。1つの勾配の最下層の下に2ミリリットルの粗ミトコンドリアペレット懸濁液を加え、第2の勾配の最下層の下に2ミリリットルの粗膜ペレット懸濁液を加える。
各グラジエントの上部に1ミリリットルの10%ヨージキサノールを慎重に重ね、必要に応じて10%ヨージキサノールを添加してチューブを互いに10マイクログラム以内にバランスさせた後、密度勾配遠心分離によってミトコンドリア画分と膜画分を精製します。分離の最後に、針を使用して薄肉チューブの側面に穴を開け、各サンプルから目に見えるバンドを収集します。核タンパク質単離のために、溶解バッファーAに懸濁された7.5ミリリットルの細胞アリコートを遠心分離し、ピペッティングとボルテックスを使用してペレットを800マイクロリットルの氷冷細胞可溶化バッファーに再懸濁します。
懸濁液を氷上で30分間インキュベートして、核タンパク質を保護しながら、血漿膜と細胞小器官を破壊します。インキュベーションの最後に、細胞懸濁液を遠心分離し、ベンゾナーゼ1マイクロリットルあたり1単位を添加した800マイクロリットルの氷冷核溶解バッファーに穏やかにピペッティングしてペレットを再懸濁します。混合物を摂氏4度のエンドオーバーエンドローテーターでインキュベートして、核膜を破壊します。
30分後、核酸を剪断するためにパルスの間に5秒間休止して、20%パワーで5秒間混合物を3回超音波処理する。最後の超音波処理の後、ホモジネートを遠心分離し、ペレットを乱すことなく核画分として上清を収集する。密度勾配精製後の各画分のウェスタンブロットは、ミトコンドリア画分の25%および30%ヨージキサノール層への局在化、および10%および15%のヨージキサノール層への膜画分の局在を示す。
西洋の血液分析では、単離された各サンプルが純粋であり、細胞の他の部分からのタンパク質による汚染がないことも確認されています。さらに、各サンプルのバンド強度の濃度測定分析により、データの再現性と統計的有意性が確認されます。分画の不適切な実行は、細胞成分の相互汚染を引き起こす可能性があります。
例えば、細胞質画分中の高濃度のヒストンH3は、細胞質画分の不適切な清澄化が原因である可能性があります。等密度密度精製中に失敗すると、膜画分が汚染される可能性があります。西洋血液分析の前にタンパク質定量アッセイを実行して、タンパク質量に基づいてゲルローディングを可能にするために画分に実際にタンパク質が含まれていることを確認し、手順が適切に実行されたことを確認すると便利です。
細胞質画分がペレットを含まないことが重要です。ウェスタンブロットまたはELISAは、特定の条件下で異なるタンパク質の細胞内位置を解析できるように、この手順に従って実行できます。この技術により、高血糖条件下でのさまざまな細胞死因子の輸送を分析することができました。
そして、私たちにとって、これはアポトーシスから壊死への高血糖シフトのメカニズムに光を当てるのに役立ちました。
