このプロトコルにより、頭蓋顔面分野の研究者は、口蓋棚の上昇中に間葉リモデリングを理解する手段として、コントロール細胞と変異細胞の集団移動属性を定量的に比較することができます。一次マウス胚性口蓋間葉細胞およびタイムラプスイメージングの使用は、口蓋棚の上昇ダイナミクスを評価するためのアクセス可能なプロキシメソッドを提供する。マウス胚から口蓋殻を収穫するには、殺菌した穿孔スプーンを使用して、胚13.5日目の胚を、立体顕微鏡の下で無菌MEPM培養培地で満たされた無菌10センチメートル皿に入れる。
切断後、殺菌された細かいNo.5鉗子の1つの先端を頬のすぐ内側の口に挿入し、頭蓋骨の後ろから出るまで鉗子の先端を押し込みます。鉗子を向け、もう一方の腕が外耳道の上をホバリングしてから、鉗子をつまんでティッシュを切るようにします。頭の反対側の切開を繰り返し、下顎、舌、および頭蓋骨の下の部分が取り除かれるまでピンチカット手順を続け、口蓋棚を露出させる。
頭を横に置き、小さな無菌のステンレス製のはさみの先端を胚の目の高さ程度の頭蓋骨の前と後ろに置き、目のすぐ上を切って頭蓋骨の頭蓋骨を取り除き、平らな表面を作り出します。次に、皿の底に平らに置く優れた側面で頭を逆さまに置き、頭の前半分の中央溝の両側に2つの隆起した橋として見えるはずの口蓋棚を見つけます。皿に頭を固定するには、口蓋棚に頭の前部の鼻領域の近くの組織を通して細かい鉗子の一方の先端を挿入し、もう一方は頭蓋骨の後部の基部を通して口蓋棚に挿入する。
非常に鋭く、棚の側面の基部のティッシュに非常に鋭い、細かい鉗子の第二のペアの両方のポイントを挿入し、ゆっくりと慎重にティッシュを切断するためにピンチ。棚の内側表面の基部に沿って切開を繰り返し、棚の前部と後端の両方で棚を取り付けから頭に取り外し、棚を穏やかに持ち上げ、必要に応じて追加のピンチを作り、周囲の組織からシェルを完全に解放します。2番目の口蓋棚が同様に取り除かれた場合、滅菌プラスチック電球転写ピペットを使用して、氷上のPBSの約500マイクロリットルで無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに棚を移します。
MEPM細胞培養をセットアップするには、すべての棚が採取された場合、組織を乱さずにPBSを吸引し、直ちに37度摂氏0.25%トリプシンの200マイクロリットルを口蓋棚組織の各チューブに加える。1,000マイクロリットルのピペットを使用して組織を数回短時間ピペットし、37°Cで10分間培養し、5分後に短時間ピペットします。インキュベーションの終わりに、各チューブに800マイクロリットルのMEPM培養培地を添加し、チューブを遠心して細胞を採取する前に、組織を再びピペットする。
上清を吸引した後、ペレットを1チューブあたり1ミリリットルの新鮮なMEPM培養培地に再懸濁し、1ウェルあたり2ミリリットルを含む6ウェル組織培養処理プレートの個々のウェルに細胞をプレートし、1ウェル当たり3ミリリットルの最終合計にプレート化し、細胞を滅菌細胞培養インキュベーターで12時間プラスチック表面に付着させる。2D集合移動アッセイを設定するには、分析するサンプルごとに約1ミリメートルの高さに1つの無菌2ウェルシリコーンインサートの上部を取り除き、滅菌鉗子を使用して、6ウェルプレートの個々のウェルの中心に短く無菌の2ウェルインサートをプレートします。すべてのエッジに沿って押し下げて、挿入物がウェルボトムに完全に接着され、細胞培養インキュベーター中の一晩インキュベートのために各インキュベートの各挿入物に40〜50マイクロリットルのMEPM培養液の合計体積で、短いシリコーン挿入物の1平方ミリメートル当たり300 MEPM細胞が完全に付着していることを確認します。
創傷修復アッセイを設定するには、無変無変の無菌2ウェルシリコーンインサートをサンプルあたり6ウェルプレートの1つのウェルの中央に配置し、挿入物の端をしっかりと押して培養プレートに取り付けます。次いで、1平方ミリメートル当たり400細胞を各挿入液中に100マイクロリットルのMEPM培地に投入し、細胞培養培地中で48時間培養した。2D集合的移動アッセイを行う場合、細胞を大きな培養皿に2ウェルシリコーンインサートに播種すると、通常、イメージングに優れた細胞密度が得られます。
35ミリメートル皿に入れた小さな3Dプリントリングも2D運動性解析に使用できます。創傷修復アッセイの場合、細胞は高い合流まで2ウェルシリコーンインサートで成長します。その後、インサートが除去され、創傷は閉鎖されるまで画像化されます。
MEPM軌道は持続性であり、細胞運動の方向は数時間維持される。平均変位対時間分析は、変位の形式での持続性が経過時間に比例していることを示します。運動性データの流れ解析では、共移動MEPM細胞クラスターのサイズは約300ミクロンである。
野生型と変異MEPM細胞の間には深い運動性の違いも認められる。この手順は、様々なトランスジェニックマウスラインで使用することができ、細胞の動きに対する効果を研究するために、様々な生化学的試薬でMEPM細胞を治療することができます。我々は、一次口蓋間葉細胞に焦点を当ててきたが、タイムラプスイメージングと定量分析は、動的発達過程における任意の運動細胞型の移動属性を探索するためにも使用することができる。
