Este protocolo permite aos investigadores do campo craniofacial comparar quantitativamente atributos de movimento coletivo no controle e células mutantes como um meio de entender a remodelação mesenquimal durante a elevação da prateleira palatal. O uso de células mesenquimais palatais embrionárias primárias do rato e imagens de lapso de tempo fornecem um método proxy acessível para avaliar a dinâmica de elevação da prateleira palatal. Para colher conchas palatais de um embrião de camundongo, use uma colher perfurada esterilizada para colocar um embrião embrionário em 13,5 em um prato estéril de 10 centímetros cheio de meio de cultura MEPM estéril sob um microscópio estéreo.
Após a decapitação, insira uma ponta de uma multa esterilizada no.5 fórceps na boca apenas dentro da bochecha e empurre a ponta dos fórceps até que saia da parte de trás do crânio. Oriente os fórceps para que o outro braço paire sobre o canal auditivo antes de beliscar os fórceps fechados para cortar o tecido. Repita a incisão do outro lado da cabeça, continuando o procedimento de corte de pinça até que a mandíbula inferior, a língua e a porção inferior do crânio tenham sido removidas, expondo as prateleiras palatais.
Com a cabeça colocada de lado, posicione as pontas de um par de tesouras pequenas, estéreis e inoxidáveis de aço na frente e atrás do crânio apenas sobre o nível dos olhos do embrião e corte logo acima dos olhos para remover o crânio do crânio, criando uma superfície plana. Em seguida, posicione a cabeça de cabeça para baixo com o aspecto superior descansando na parte inferior do prato e localize as prateleiras palatais, que devem ser visíveis como duas pontes levantadas em ambos os lados da ranhura central na metade anterior da cabeça. Para fixar a cabeça no prato, insira uma ponta de um fórceps fino através do tecido perto da região nasal da cabeça anterior às prateleiras palatais, e a outra através da base do crânio posterior às prateleiras palatais.
Insira ambos os pontos de um segundo par de fórceps muito afiados e finos no tecido na base da superfície lateral da prateleira e lentamente e cuidadosamente beliscar para cortar o tecido. Repita a incisão ao longo da base da superfície medial da prateleira e nas extremidades anterior e posterior da prateleira para desprender a prateleira de seu acessório para a cabeça, em seguida, levante suavemente a prateleira, fazendo pitadas adicionais conforme necessário para libertar completamente a casca do tecido circundante. Quando a segunda prateleira palatal tiver sido removida da mesma forma, use uma pipeta de transferência de lâmpada plástica estéril para transferir as prateleiras para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro estéril em aproximadamente 500 microlitrais de PBS no gelo.
Para configurar uma cultura celular MEPM, quando todas as prateleiras foram coletadas, aspire o PBS sem perturbar os tecidos e adicione imediatamente 200 microlitrais de 37 graus Celsius 0,25% de trippsina a cada tubo de tecido de prateleira palatal. Use uma pipeta de 1.000 microliter para pipetar brevemente os tecidos algumas vezes e incubar os tecidos por 10 minutos a 37 graus Celsius, pipetando brevemente após cinco minutos. No final da incubação, pipeta os tecidos novamente antes de adicionar 800 microliters de cultura MEPM meio a cada tubo e centrifugar os tubos para coletar as células.
Depois de aspirar o supernaspe, resuspenque as pelotas em um mililitro de cultura MEPM fresca por tubo, e emplaque as células em poços individuais de uma placa tratada com cultura de tecido de seis poços contendo dois mililitros por poço a um total final de três mililitros por poço, em seguida, permitir que as células aderam à superfície plástica por 12 horas em uma incubadora de cultura celular estéril. Para configurar um ensaio de migração coletiva 2D, remova a parte superior de uma inserção de silicone estéril de dois poços a uma altura de aproximadamente um milímetro para cada amostra a ser analisada e use fórceps estéreis para emplacar as inserções encurtadas e estéreis de dois poços no centro de poços individuais de uma placa de seis poços. Pressione para baixo ao longo de todas as bordas para garantir que as pastilhas sejam totalmente aderidas aos fundos do poço e sementes 300 células MEPM por milímetro quadrado das pastilhas de silicone encurtadas em um volume total de 40 a 50 microliters de meio de cultura MEPM em cada inserção para uma incubação durante a noite na incubadora de cultura celular.
Para configurar um ensaio de reparação de ferida, use fórceps estéreis para colocar uma inserção de silicone estéril não modificada no centro de um poço de uma placa de seis poços por amostra e pressione firmemente as bordas da inserção para anexar a inserção à placa de cultura. Em seguida, semente 1.400 células por milímetro quadrado em 100 microliters de meio de cultura MEPM em cada inserção e incubar as células por 48 horas no meio de cultura celular. Ao realizar um ensaio de migração coletiva 2D, semear as células em inserções de silicone de dois poços em um prato de grande cultura normalmente fornece melhor densidade celular para imagem.
Pequenos anéis impressos em 3D colocados em um prato de 35 milímetros também podem ser usados para análise de motilidade 2D. Para ensaios de reparação de feridas, as células são cultivadas em inserções de silicone de dois poços até alta confluência. As pastilhas são então removidas e a ferida é imageda até o fechamento.
As trajetórias do MEPM são persistentes e a direção da motilidade celular é mantida por várias horas. A análise média de deslocamento versus tempo indica que a persistência na forma de deslocamento é proporcional ao tempo decorrido. A análise de fluxo dos dados de motilidade revela que os aglomerados de células MEPM co-movendo têm aproximadamente 300 mícrons de tamanho.
Uma profunda diferença de motilidade entre células mepm selvagens e mutantes também é observada. Este procedimento poderia ser usado em várias linhas de camundongos transgênicos e para tratar células MEPM com vários reagentes bioquímicos para estudar seus efeitos sobre o movimento celular. Focamos em células primárias de mesenquime palatal, mas as imagens de lapso de tempo e análises quantitativas também podem ser usadas para explorar os atributos de migração de qualquer tipo de célula motil em processos dinâmicos de desenvolvimento.
