Этот протокол позволяет исследователям в черепно-лицевой области количественно сравнивать коллективные атрибуты движения в контрольных и мутантных клетках как средство понимания ремоделирования мезенхимальных мешков во время подъема небного шельфа. Использование первичных эмбриональных мезенхимальных клеток небной области мыши и покадровая визуализация обеспечивают доступный прокси-метод для оценки динамики подъема небной полки. Чтобы собрать небные раковины с эмбриона мыши, используйте стерилизованную перфорированную ложку, чтобы поместить эмбриональный эмбрион 13,5 дня в стерильную 10-сантиметровую чашку, наполненную стерильной питательной средой MEPM под стереомикроскопом.
После обезглавливания вставьте один кончик стерилизованного тонкого щипца No 5 в рот прямо внутри щеки и протолкните кончик щипцов, пока он не выйдет из задней части черепа. Ориентируйте щипцы так, чтобы другая рука парила прямо над ушным каналом, прежде чем защемить щипцы, чтобы разрезать ткань. Повторите разрез на другой стороне головы, продолжая процедуру разреза до тех пор, пока нижняя челюсть, язык и нижняя часть черепа не будут удалены, обнажая небные полки.
Поместев голову на бок, расположите кончики пары маленьких, стерильных ножниц из нержавеющей стали перед и позади черепа примерно на уровне глаз эмбриона и разрезайте чуть выше глаз, чтобы удалить череп черепа, создавая плоскую поверхность. Затем расположите голову вверх ногами с верхним аспектом, лежащим ровно на дне чашки, и найдите небные полки, которые должны быть видны в виде двух приподнятых мостиков по обе стороны центральной канавки в передней половине головы. Чтобы закрепить голову к блюду, вставьте один кончик тонкого щипца через ткань возле носовой области головы, перед небными полками, а другой через основание черепа с задней стороны к небным полкам.
Вставьте обе точки второй пары очень острых, тонких щипцов в ткань у основания боковой поверхности полки и медленно и осторожно защемите, чтобы разрезать ткань. Повторите разрез вдоль основания медиальной поверхности полки и как на переднем, так и на заднем концах полки, чтобы отсоединять полку от ее крепления к головке, затем осторожно приподнимите полку, сделав дополнительные щипцы по мере необходимости, чтобы полностью освободить оболочку от окружающих тканей. Когда вторая небная полка будет удалена таким же образом, используйте стерильную пластиковую лампочную передаточную пипетку для переноса полок в стерильную микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра примерно в 500 микролитров PBS на льду.
Чтобы создать культуру клеток MEPM, когда все полки будут собраны, аспирировать PBS, не нарушая ткани, и немедленно добавить 200 микролитров 37 градусов Цельсия 0,25% трипсина в каждую трубку ткани небной полки. Используйте пипетку 1000 микролитров, чтобы ненадолго пипетку тканей несколько раз и инкубировать ткани в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия, пипетируя ненадолго через пять минут. В конце инкубации снова пипетку тканей, прежде чем добавлять 800 микролитров питательной среды MEPM в каждую трубку и центрифугировать трубки для сбора клеток.
После аспирации супернатанта повторно суспендируют гранулы в одном миллилитрах свежей питательной среды MEPM на пробирку и накладывают клетки в отдельные лунки из шестияментной обработанной культурой тканей пластины, содержащей два миллилитра на лунку, до окончательного общего количества трех миллилитров на лунку, а затем позвольте клеткам прилипать к пластиковой поверхности в течение 12 часов в стерильном инкубаторе клеточной культуры. Чтобы создать 2D коллективный миграционный анализ, удалите верхнюю часть одной стерильной двухствольной силиконовой вставки на высоту около одного миллиметра для каждого анализируемого образца и используйте стерильные щипцы для нанесения укороченной, стерильной двухствольной вставки в центр отдельных скважин шестиязычной пластины. Прижмите по всем краям, чтобы убедиться, что вставки полностью прилипли к днищу скважины, и засевите 300 клеток MEPM на квадратный миллиметр укороченной силиконовой вставки в общем объеме от 40 до 50 микролитров культуральной среды MEPM в каждую вставку для ночной инкубации в инкубаторе клеточной культуры.
Чтобы настроить анализ для заживки раны, используйте стерильные щипцы, чтобы поместить одну неизмененную стерильную двухсквазную силиконовую вставку в центр одной скважины шестисквазочной пластины на образец и плотно прижать края вставки, чтобы прикрепить вставку к культурально-пластиной. Затем посейте 1, 400 клеток на квадратный миллиметр в 100 микролитрах культурального материала MEPM в каждую вставку и инкубируют клетки в течение 48 часов в клеточной культурной среде. При выполнении 2D-коллективного миграционного анализа засев клеток в двухщелточные силиконовые вставки в большой чашке для культивирования обычно обеспечивает лучшую плотность клеток для визуализации.
Небольшие 3D-печатные кольца, помещенные в 35-миллиметровую тарелку, также могут использоваться для 2D-анализа подвижности. Для анализа заживки ран клетки выращивают в двухлуночных силиконовых вставках до высокого слияния. Затем вставки удаляются, и рана визуазируется до закрытия.
Траектории MEPM являются постоянными, а направление подвижности клеток сохраняется в течение нескольких часов. Анализ среднего смещения и времени показывает, что стойкость в виде смещения пропорциональна прошедшему времени. Анализ потока данных о подвижности показывает, что ко-движущиеся кластеры клеток MEPM имеют размер около 300 микрон.
Также наблюдается глубокая разница подвижности между клетками дикого типа и мутантными КЛЕТКАМИ MEPM. Эта процедура может быть использована на различных трансгенных линиях мышей и для лечения клеток MEPM различными биохимическими реагентами для изучения их влияния на движение клеток. Мы сосредоточились на первичных клетках небной мезенхимы, но покадровая визуализация и количественный анализ также могут быть использованы для изучения миграционных атрибутов любого подвижного типа клеток в динамических процессах развития.
