このプロトコルにより、マウス胚の発生時にイメージングが可能になります。これにより、初期の心新生を詳細に研究することができます。偽の胚の静止画像を撮影するのと同様に、ライブイメージングは、胚発生における動的なプロセスを研究するための完全なアクセスを提供します。
ライフイメージングに必要なスキルは、テキストのみの出版物では把握しにくいものです。他の人がそれをしているのを見るのは学ぶことが不可欠です。まず、長さ1センチのタングステン線片を切り取り、ワイヤーの先端を飽和硝酸ナトリウム溶液に浸して直径0.02〜0.05ミリメートルに研ぎます。
エルボー付きガラスキャピラリーを準備するには、標準の1ミリメートルのガラスキャピラリーの中点をブンゼンライターの上に3〜6秒間置き、キャピラリーが薄く柔軟になるまで両端からゆっくりと引っ張ります。次に、キャピラリーを半分に分割し、短時間加熱して、先端から2センチメートルの90度の曲げを生成します。長さ約7ミリメートル、幅4ミリメートル、厚さ2ミリメートルのポリメチルメタクリレートの部分を見ました。
ベンチバイスを使用してメタクリレートピースを保持し、ピース全体に横方向にカスタマイズされた穴を開けます。ドリルをゆっくりと回転させながら、低いながらも一定の圧力をかけます。細かいやすりを使用してホルダーの端を滑らかにし、サイズを調整します。
さらに、胚の位置決めを容易にするために、ホルダーの端に緩やかな傾斜を作成します。完成したホルダーを蒸留水の入った皿に入れてすすぎます。実体顕微鏡で、ホルダーをチェックして、穴にドリルダストが含まれているかどうかを確認します。
ほこりがある場合は、タングステン針を使用して取り除きます。ホルダーを滅菌するには、蒸留水で満たされた円錐形のチューブに入れ、最低20ワットの電力出力で20分間超音波処理します。安楽死させた胎生6.75〜7.5日目の妊娠マウスから子宮を抽出し、乾いた清潔な紙のおしりふきの上に置きます。
次に、子宮を切断し、メソメトリー側から細かいハサミの先端を挿入し、刃をスライドさせて決定を露出させ、解剖培地に移します。胚を解剖し、外胎盤円錐を無傷に保ちます。次に、ライヒター膜を剥がし、その一部を余分な胚領域に残します。
解剖培地を暖かく保つために、10分ごとに交換してください。さらに、3〜4人のグループで決定を解剖し、残りは摂氏37度の浴に入れた解剖培地に入れます。解剖した胚を直ちに培養液に入れる。
蛍光実体顕微鏡を使用して目的の蛍光特徴を持つ胚を選択し、細胞培養インキュベーター内の培養液を含むチューブに入れて、イメージングする前に2時間回収します。コンピューター、ソフトウェア、レーザーを含むすべての顕微鏡コンポーネントの電源を入れた後、二酸化炭素コントローラーの電源を入れて7%に設定しますガラスカバースリップ底のある35ミリメートルの皿に高真空シリコングリースを一滴置きます。ホルダーをドロップの上に置き、軽く押して固定します。
胚マウントのために、2〜3個の胚をインキュベーターからホルダー付きの皿に移します。一対の鉗子と先細のタングステン針を使用して、胚を穴に入れます。針を使用して、外胎盤円錐で胚を引っ掛け、サイズに合った穴に挿入します。
胚とホルダーが入っている皿を顕微鏡プレートに慎重に移動します。中程度の対物レンズ界面に液体メニスカスが形成されるまで対物レンズを下げます。胚に焦点を合わせた後、インキュベーションチャンバーを取り付け、テープを使用して対物レンズの周りに密封します。
顕微鏡制御ソフトウェアでのライブキャプチャを使用して、レーザー出力とゲインレベルを調整します。次に、培地を対物レンズ上にゆっくりと滴下してパラフィンオイルで覆います。タイムラプス録画を設定します。
スタック間に3〜5ミクロンのZスペースを配置して5〜10分の間隔を設定します。Zスタックの上に空白を残して、胚の成長を予測します。最低50ミクロン、取得が監視されない時間ごとに30ミクロンを追加します。
自動保存オプションを有効にすると、コンピューターからの取り込みを監視でき、必要に応じてZスタックサイズを調整して、焦点内の関心領域に合わせることができます。多光子イメージングによる生きた全身胚心臓の発達を示す。胚7.5日目には、静脈蛍光が神経外胚葉全体に存在し、内臓および胚外中胚葉にいくつかの陽性核があります。
4時間後、内皮前駆細胞は静脈を活性化し、集合して心内膜管とその下にある大動脈を形成し、7時間後に閉鎖構造になります。ライヒターの膜を取り除くときは注意してください。それは、特に動揺前の段階で、本当に胚にくっつく可能性があります。
除去中は、余分な胚領域で膜をつまむようにしてください。
