このプロトコルは、眼疾患ニューロンの微細形態の調査を可能にし、疾患状態で起こる細胞および細胞下形態変化に関する洞察を与えることができる。この方法は、レチナの光透過性を大幅に向上させ、ホルモンのレチナ調製物における高解像、3次元イメージング、回路配線、および細かい細胞下の細胞構造を可能にする。湾曲した鉗子でマウスの目を核とし、0.1 M PBSの小さなペトリ皿に移します。
角膜強膜接合部に沿って小さな穴を開けて針を解剖顕微鏡で針に突き刺し、その後、眼を4%パワーホルムアルデヒドに1時間移します。目をPBSの皿に戻します。解剖顕微鏡の下で、角膜側接合部の周りのすべての方法を切断するために解剖はさみを使用してください。
角膜とレンズを取り外します。その後、視神経の基部でそれをカットし、慎重に残りの部分を分離するために鉗子で強皮を剥がします。レティナの周りに4つの小さなカットを均等に行い、PBSに浸した細かい先端ブラシを使用して、ニトロセルロース濾紙から切り取られた小さな正方形のクローバーのような形で平らなGCL側に置きます。
ニトロセルロース紙の隅を鉗子で拾い、4%パワーホルムアルデヒドを備えた48ウェルプレートに1時間置き、フィルターペーパーとレチナをPBSで井戸に移し、それぞれ5分間3回洗浄します。氷の上にA4P0溶液を解凍します。その後、A4P0溶液にレチナを移し、穏やかな攪拌で摂氏4度で一晩インキュベートします。
植物油を井戸に加えて、A4P0溶液を完全にカバーします。摂氏40度の水浴で3時間、揺れずとインキュベートします。その後、PBSで1回5分間洗浄します。
穏やかな揺れで摂氏40度で10%のデセシル硫酸ナトリウムでレティナをインキュベートし、濾紙とレティナをトリトンX-100でPBSに移し、1回の洗浄で90分間5回洗浄します。最終洗浄後、0.01%のアジドナトリウムでPBS-Tに摂氏4度でレチナを保存するか、免疫染色に直接移動します。PBS-Tの細かい先端ブラシで軽く剥がして、フィルター紙からレチナを取り除きます。
穏やかな揺れで摂氏40度で2日間ブロッキング溶液で希釈された一次抗体でインキュベート。インキュベーション後、PBS-Tで90分間5回洗浄する。緩やかな揺れで摂氏40度で2日間ブロッキング溶液に希釈された適切な二次抗体でレティナをインキュベートする。
手順の残りの部分を通して、光からサンプルを保護します。0.02 Mリン酸緩衝液で90分間、レチナを5回洗浄します。最後に、ソルビトールベースの屈折率マッチング溶液で、一晩穏やかな揺れで摂氏40度でレチナをインキュベートします。
ガラス顕微鏡スライドの背面に正方形の境界をマークするために、細かい先端の永久マーカーでガラスカバースリップを概説します。スライドを裏返し、シリンジを使用して、スライドの前面にシリコーングリースの細い線で境界をトレースします。脱出するために余分な取り付け溶液のために1つのコーナーに小さなギャップを残します。
有形領域の中央にレチナを移し、ガラススライドに対して感光体側と平らに横たわるように細かい先端ブラシで配置します。ピペットは約60マイクロリットルのsRIMSを平らにされたレチナを覆い、エンクロージャの一角まで伸びるようにする。レティナが平らで所定の位置に保たれていることを確認します。
sRIMSでコーナーから始めてカバースリップを塗布し、すべての側面のグリースに触れるまでゆっくりと下げます。取り付けられたレティナの両側に3つのカバースリップの積み重ねをスペーサーとして置きます。別のスライドの長い端を使用してカバースリップを押し下げて、マウントが平らで均等になるようにします。
スライドは、イメージングまで摂氏4度で保存します。顕微鏡のステージにスライドを配置し、サンプルを見つけることから始めます。サンプルのZ積層画像を取得するには、まず各チャンネルの信号に個別に焦点を合わせ、それぞれ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡の露光時間または走査速度を設定します。
目的の範囲の上下に焦点面を手動で設定するか、中点を設定してから中点の周りの範囲を指定して、Z スタックの範囲を設定します。必要に応じて、ステップサイズまたはスライス数を調整します。イメージをキャプチャし、元のファイルを保存します。
その後、TIF ファイルまたは別の目的の形式としてエクスポートされます。画像解析を使用して、単一の画像とZスタックの3次元レンダリングの両方で最適な明瞭さが達成されるまで、各チャンネルの明るさとコントラストを調整するためのソフトウェアを使用します。修飾されたCLARITYプロトコルで処理した場合、レチナの厚さ全体にわたって完全な光学透過性が観察され、非処理制御レチナと比較した。
ONLのスタフィンラベル付きコーンのZ積み重ね画像、INLのDACのラベル付けされたTH、GCLのRMCにマークされたRBPMSがここに示されています。全厚さのレティナ全体のニューロンの相対的な位置は、オーバーレイ画像で観察された。TH染色とCLARITY処理全体のマウントレチナを標準的な準備から得られた画像と比較した。
DAのデンドライトと軸索のようなプロセスは、標準的なレチナよりも明瞭に処理された経後で明らかにされた。DACの軸索状のプロセスは、標準的なレチナと比較して、明瞭なレティナで完全なリング状の構造を示した。蛍光顕微鏡を用いて採取したCLARITYレティナのリング状構造は、共焦点顕微鏡を用いて観察されたものとほぼ同じであった。
軸索のようなプロセスも外側のレティナに向かって走った。GluA2およびPSD-95に対する免疫染色は、それぞれAMPA受容体および推定ポストシナプス部位を含む個々のGluA2を明らかにし、明確な穿刺を示した。オーバーレイ画像は、DACプロセス上のいくつかのパンクタを示しました。
推定共局在化のポイントは、XZ、YZ、およびXY平面で提示され、THはGluA2とPSD-95の両方と明確に共局化した。クリアされたレティナが取り付けおよびイメージングプロセスのために平らに置くことができるように、ヒドロゲル重合プロセス中にレティナが平らなままである事が重要です。
