Cryo Soft X선 단층 촬영은 독립형으로 또는 다른 이미징 기술과 함께 사용할 수 있는 세포 수준에서 정량적으로 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. 염색 또는 절편화가 필요한 동결된 수화 상태의 센서 이미지. 또한 각 단층 촬영이 단 몇 분 만에 수집되기 때문에 처리량이 높은 기술입니다.
소프트 X선 냉동 단층 촬영은 단일 세포 수준에서 감염되거나 결함이있는 세포에서 세포 복원 과정을 따르기위한 완벽한 플랫폼을 제공합니다. 이 기술은 새로운 항바이러스 약물 또는 유전자 요법의 효능을 보고하여 편집된 표현형의 감염을 되돌릴 수 있다. 투과 X선 현미경에 샘플을 적재하려면 100켈빈 미만에 도달할 때까지 액체 질소로 이송 챔버를 냉각하십시오.
워크 스테이션을 추가 액체 질소로 채우고 워크 스테이션 림의 히터를 켭니다. 워크스테이션 림이 끓는 것을 멈추면 그리드가 들어있는 냉동 상자를 냉동 조건에서 워크스테이션의 적절한 위치에 놓고 그리드를 이전에 냉각된 샘플 홀더에 로드합니다. 홀더를 셔틀에 싣고 덮개로 보호하십시오.
셔틀을 100켈빈 미만의 이송 챔버에 적재하고 챔버를 저진공으로 펌핑합니다. 이송 챔버를 현미경에 부착하고 화면의 진공 절차를 따라 이송 챔버 셔틀을 현미경으로로드하십시오. 셔틀이 샘플과 함께 현미경에 있으면 현미경 로봇 암을 사용하여 하나의 샘플 홀더를 샘플 스테이지로 옮깁니다.
온라인 가시 광선 현미경으로 그리드의 밝은 필드 이미징을 위해 가시 광선 현미경 카메라를 선택하고 밝은 필드 이미징을 위해 가시 광선 현미경 LED 소스를 켭니다. 동작, 제어, 샘플 및 샘플 세타를 클릭하여 샘플을 영하 60도로 회전하여 가시광선 현미경 목표를 향하도록 한 다음 동작 제어 및 샘플을 선택하고 샘플 X와 샘플 Y를 변경하여 샘플을 예상 중심 위치로 이동합니다. 현미경, 수집, 수집 설정, 수집 모드, 연속 및 시작을 선택하고 모션 제어 및 샘플을 클릭하여 샘플 Z를 선택하여 셀 및/또는 탄소 지지 필름의 구멍에 초점을 맞출 때까지 다섯 미크론까지 더 작은 단계로 초점을 미세화합니다.
그런 다음 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드, 모자이크 및 시작을 선택하여 모자이크의 기본값을 사용하여 밝은 필드 모드에서 그리드의 전체 모자이크 맵 획득을 시작합니다. 형광 모드 모자이크 이미징의 경우 밝은 필드 이미징을 위해 가시광선 현미경 LED 소스를 끄고 원하는 여기 파장에 해당하는 LED 광원과 해당 광학 필터를 수동으로 선택하십시오. 현미경, 수집, 수집 설정, 수집 모드, 연속 및 시작을 선택하고 모션 제어 및 샘플을 클릭하여 샘플 Z를 선택하여 형광 이미지에 초점을 맞춥니다.
그런 다음 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드, 모자이크 및 시작을 클릭하여 밝은 필드 모자이크에서 위치 X 및 Y 매개 변수를 유지하는 모자이크 맵을 가져옵니다. 그런 다음 LED 광원을 끕니다. X선 모자이크 수집의 경우, 출구 슬릿을 다섯 미크론으로 변경하고 MISTRAL에서 1초 노출을 사용합니다.
현미경, 수집, 수집 설정, 카메라 설정 및 비닝을 선택하여 샘플 Z 변환을 사용하여 초점을 조정합니다. 모션 컨트롤 및 샘플을 선택하여 샘플 Z를 선택합니다.5미크론 단계부터 셀이나 카본 호일 구멍에 초점이 맞춰질 때까지 초점을 0.5미크론 단계로 세분화합니다. 메쉬 사각형의 모자이크 맵을 가져오려면 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드, 모자이크 및 시작을 클릭합니다.
맵을 획득하면 동작 제어 및 샘플을 클릭하고 샘플 X와 샘플 Y를 변경하여 샘플을 플랫 필드 위치로 이동합니다. MISTRAL에서 노출 시간을 일초로 설정합니다. 그 후, 획득한 모자이크를 평탄한 필드 영상에 의해 정규화하여 전송을 획득하고 정규화된 모자이크를 저장한다.
회전 축의 샘플을 영도에서의 회전과 정렬하려면 동작 제어 및 샘플을 선택하고 샘플 X, 샘플 Y 및 샘플 Z를 변경하여 회전 축에 배치할 셀의 피쳐에 초점을 맞춥니다. 샘플을 양의 세타 위치로 회전하려면 동작 제어 및 샘플을 선택하고 샘플 세타를 양수 세타로 변경합니다. 선 도구를 사용하여 셀의 피쳐에 선을 그려 회전 축을 배치합니다.
샘플을 음수 세타 위치로 회전하려면 동작 제어 및 샘플을 선택하고 샘플 세타를 음수 세타로 변경합니다. 선 도구를 사용하여 셀의 피쳐에 선을 그려 회전 축을 배치합니다. 양수 또는 음의 세타 위치에 있는 동안 샘플 Z 변환을 사용하여 선택한 피쳐를 두 선 사이의 중심 위치로 이동하고 최소 라인 간 거리가 확보될 때까지 샘플 회전을 반복합니다.
샘플 세타가 0이면 선택한 피쳐를 시야각의 중앙에 배치하는 데 필요한 거리의 두 배로 샘플 X를 이동하고 영역 플레이트 X를 이동하여 피쳐를 다시 시야각의 중앙으로 가져옵니다. 새 회전 축에 대해 영역 플레이트 Z 위치를 다시 최적화하려면 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드 및 초점 시리즈를 선택하고 시작을 클릭하여 영역 플레이트 Z 초점 시리즈를 기록합니다. 그런 다음 모션 컨트롤 및 존 플레이트를 클릭하고 영역 플레이트 Z를 선택하여 영역 플레이트 Z를 샘플이 초점이 맞춰진 위치로 이동합니다.
토모그램을 얻으려면 동작 제어 및 샘플을 클릭하고 샘플 세타를 선택하여 음의 최대 각도를 더하기 0.1로 이동합니다. 현미경, 획득, 획득 설정, 획득 모드 및 단층 촬영을 클릭하여 각도 0 및 각도 범위의 이미지를 고려하여 이미지 수를 총 각도 수로 설정하고 이미지 수를 설정합니다. 앵글 시작 및 앵글 엔드를 선택하고 현미경, 획득, 획득 설정, 카메라 설정을 클릭하고 노출 시간을 설정합니다.
시작을 클릭하여 단층 촬영 틸트 시리즈의 수집을 시작합니다. 이상적인 샘플은 얇은 얼음 층에 내장 된 사각형 메쉬의 중앙에 단일 셀이 있어야하며 잘 분산 된 금 신탁 마커로 둘러싸여 있어야합니다. 미토콘드리아, 소포체, 액포 및 핵과 같은 많은 다른 소기관들은 선형 흡수 계수의 정량적 재구성 덕분에 최종 재구성된 단층 촬영에서 구별될 수 있어야 한다.
이 이미지에서는 더 높은 셀 밀도를 가진 사각형을 관찰 할 수 있습니다. 이 예에서, 블롯팅은 덜 효율적이었고, 균열이 있는 더 두꺼운 얼음층으로 이어졌다. 이 준비에서 일부 더 큰 구조물을 인식 할 수 있지만, 두꺼운 얼음의 유리화 품질이 좋지 않아 소음과 거친 질감 내에서 미세한 세부 사항이 손실되었습니다.
냉동 보존 샘플은 최소한으로 처리되어야 하는데, 이는 대부분의 아티팩트가 이 단계에서 샘플이 생성될 때 유도되기 때문입니다. 보통, 상관관계 cryo-가시광선 광현미경 검사는, 냉동 기판 단층 촬영 전에 사용한다. 또한, 스펙트럼 현미경 검사는 관련 화학 원소에서 수행 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 다른 직접 이미징 기술로 쉽게 접근 할 수없는 시편 및 해상도 체계에서 작동하여 틈새 시장을 채우고 몇 미크론과 30 나노 미터 반 피치 해상도를 허용합니다.
