La tomografía de rayos X Cryo Soft puede proporcionar información cuantitativa valiosa a nivel celular que se puede utilizar como independiente o junto con otras técnicas de imagen. Imagen del sensor en estado hidratado congelado que son necesarios para la tinción o seccionamiento. Además, es una técnica de alto rendimiento, porque cada tomograma se recoge en solo unos minutos.
La criotomografía de rayos X suave ofrece una plataforma perfecta para seguir el proceso de restauración celular en células infectadas o defectuosas a nivel de una sola célula. Esta técnica puede informar la eficacia de nuevos medicamentos antivirales o terapia génica para revertir la infección de fenotipos redactados. Para cargar muestras en el microscopio de rayos X de transmisión, enfríe la cámara de transferencia con nitrógeno líquido hasta que alcance menos de 100 Kelvin.
Llene la estación de trabajo con nitrógeno líquido adicional y encienda el calentador de la llanta de la estación de trabajo. Cuando el borde de la estación de trabajo deje de hervir, coloque la caja criogénica que contiene las rejillas en los lugares apropiados de la estación de trabajo en condiciones de crio y cargue las rejillas en los soportes de muestra previamente enfriados. Cargue los soportes en el transbordador y protéjalos con las cubiertas.
Cargue el transbordador en la cámara de transferencia a menos de 100 Kelvin y bombee la cámara a bajo vacío. Conecte la cámara de transferencia al microscopio y siga el procedimiento de vacío en la pantalla para cargar el transbordador de la cámara de transferencia en el microscopio. Una vez que el transbordador esté en el microscopio con las muestras, use el brazo robótico del microscopio para transferir un soporte de muestra a la etapa de muestra.
Para obtener imágenes de campo brillante de la rejilla con el microscopio de luz visible en línea, seleccione la cámara de microscopio de luz visible y encienda la fuente LED de microscopio de luz visible para obtener imágenes de campo brillante. Haga clic en Movimiento, Control, Muestra y Muestra theta para girar la muestra a menos 60 grados de modo que se enfrente al objetivo del microscopio de luz visible, y seleccione Control de movimiento y Muestra y cambie la muestra X y la muestra Y para mover la muestra a las posiciones centradas esperadas. Seleccione Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Modos de adquisición, Continuo e Inicio y haga clic en Control de movimiento y muestra para seleccionar la muestra Z para refinar el enfoque con pasos más pequeños de hasta cinco micras hasta que las celdas y / o los orificios de la película de soporte de carbono estén enfocados.
A continuación, seleccione Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Modos de adquisición, Mosaico y Comenzar para iniciar la adquisición de un mapa de mosaico completo de la cuadrícula en modo de campo brillante utilizando los valores predeterminados para el mosaico. Para las imágenes de mosaico en modo de fluorescencia, apague la fuente LED del microscopio de luz visible para imágenes de campo brillante y seleccione la fuente de luz LED correspondiente a la longitud de onda de excitación deseada y el filtro óptico correspondiente manualmente en la configuración. Seleccione Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Modos de adquisición, Continuo e Inicio y haga clic en Control de movimiento y muestra para seleccionar la muestra Z y refinar el enfoque en la imagen de fluorescencia.
A continuación, haga clic en Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Modos de adquisición, Mosaico y Comenzar para adquirir un mapa de mosaico que conserve los parámetros posicionales X e Y del mosaico de campo brillante. Luego, apague la fuente de luz LED. Para la adquisición de mosaico de rayos X, cambie la ranura de salida a cinco micras y use una exposición de un segundo en MISTRAL.
Seleccione Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Configuración de cámara y Binning para ajustar el enfoque mediante la traducción Z de muestra. Seleccione Control de movimiento y muestra para seleccionar la muestra Z.Comenzando en pasos de cinco micras, refine el enfoque hasta pasos de 0,5 micras hasta que la celda o los orificios de la lámina de carbono estén bien enfocados. Para adquirir un mapa de mosaico del cuadrado de malla, haga clic en Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Modo de adquisición, Mosaico e Inicio.
Cuando se haya adquirido el mapa, haga clic en Control de movimiento y muestra y cambie la muestra X y la muestra Y para mover la muestra a una posición de campo plano. Establezca el tiempo de exposición en un segundo en MISTRAL. Luego, normalice el mosaico adquirido por la imagen de campo plano para obtener la transmisión y guardar el mosaico normalizado.
Para alinear la muestra en el eje de rotación con la rotación a cero grados, seleccione Control de movimiento y Muestra y cambie la muestra X, la muestra Y y la muestra Z para centrarse en la función de la celda que se va a colocar en el eje de rotación. Para girar la muestra a una posición theta positiva, seleccione Control de movimiento y Muestra y cambie Sample theta a theta positiva. Utilice la herramienta de línea para dibujar una línea en la función de la celda que se va a colocar en el eje de rotación.
Para girar la muestra a una posición theta negativa, seleccione Control de movimiento y Muestra y cambie la theta de muestra a theta negativa. Utilice la herramienta de línea para dibujar una línea en la función de la celda que se va a colocar en el eje de rotación. Mientras esté en posición theta positiva o negativa, utilice la traslación Z de la muestra para mover la función seleccionada a la posición central entre ambas líneas y repita la rotación de la muestra hasta obtener una distancia mínima de línea a línea.
Cuando la muestra sea igual a cero, mueva la muestra X el doble de la distancia necesaria para colocar la función seleccionada en el centro del campo de visión y mueva la placa de zona X para devolver la función al centro del campo de visión. Para volver a optimizar la posición Z de la placa de zona con respecto al nuevo eje de rotación, seleccione Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Modos de adquisición y Serie focal y haga clic en Iniciar para registrar una serie focal Z de placa de zona. A continuación, haga clic en Control de movimiento y Placa de zona y seleccione placa de zona Z para mover la placa de zona Z a la posición en la que la muestra está enfocada.
Para adquirir un tomograma, haga clic en Control de movimiento y muestra y seleccione Sample theta para mover el ángulo máximo negativo a más 0.1. Haga clic en Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Modos de adquisición y Tomografía para establecer el número de imágenes como el número total de ángulos, teniendo en cuenta la imagen en ángulo cero y el rango angular, y establecer el número de imágenes. Seleccione Ángulo de inicio y Ángulo final, haga clic en Microscopio, Adquisición, Configuración de adquisición, Configuración de cámara y establezca el tiempo de exposición.
Haga clic en Iniciar para iniciar la adquisición de la serie de inclinación de tomografía. La muestra ideal debe tener células individuales en el centro de una malla cuadrada incrustada en una capa delgada de hielo y rodeada de marcadores fiduciarios de oro bien dispersos. Muchos orgánulos diferentes, como las mitocondrias, la retícula endoplásmica, las vacuolas y el núcleo deben poder distinguirse en el tomograma reconstruido final, gracias a la reconstrucción cuantitativa de los coeficientes de absorción lineal.
En esta imagen, se puede observar un cuadrado con mayor densidad celular. En este ejemplo, la mancha fue menos eficiente, lo que llevó a una capa de hielo más gruesa con grietas. A pesar de que algunas estructuras más grandes se pueden reconocer en esta preparación, los detalles finos se perdieron dentro del ruido y la textura granulosa debido a la mala calidad de vitrificación del hielo grueso.
La muestra crioconservada debe manejarse mínimamente, ya que la mayoría de los artefactos se inducen cuando las muestras se encuentran en esta etapa. Por lo general, la fotomicroscopía de luz criovisible correlativa, se utiliza una tomografía de sustrato previo a la crioestrate. Además, la microscopía espectral se puede hacer en elementos químicos relevantes.
Este protocolo llena un nicho al operar en un régimen de muestra y resolución, que no son fácilmente accesibles por ninguna otra técnica de imagen directa, lo que permite pocas micras y una resolución de medio paso de 30 nanómetros.
