このプロトコルは、液体培地中のC.elegans運動活動を迅速に定量化するために2つの異なる半自動アッセイを使用し、C.elegans疾患モデルにおける薬物スクリーニングに適用される可能性を有する。この2つの技術の主な利点は、使いやすさと再現性の容易さです。どちらの手法も、可変スループットでワームの行動に対する薬物効果を評価する可能性があります。
これらの運動性アッセイは、動物の神経筋系が障害されるC.elegansミトコンドリア病モデルの運動活動を評価するのに有用である。関心のある薬物治療の有無にかかわらずNGMプレート上の変異ワーム株の制御をL4ステージに同期させた後、ガラススライド上の液体媒体中のC.elegans locomotor活性を分析するには、ワームピックと実体顕微鏡を使用して、1株当たり5つのワームを選び、ガラススライド上のS.基底溶液の個々の20マイクロリットルの低下に状態を示します。異なるNGMプレートから同じ実験条件から同じスライド上の複数の液滴にワームを追加して、複数の技術的複製を取得します。
すべてのワームが収集されたら、動物が室温で1分間スライドに慣れさせ、各ドロップでワームが15フレーム/ドロップで1分間泳ぐ活動を記録します。ZebraLabソフトウェアを使用して記録されたC.elegans運動活動を分析するには、ZEBRALAB AVIオプションを使用してソフトウェアにビデオをアップロードします。[AVI ファイルを使用したクオンタイズ]オプションをクリックします。
新しいプロトコルを作成するには、[パラメータ]、[プロトコル パラメータ]、[時間]の順に選択し、実験期間を 1 分に設定します。[タイムビンなし]を選択し、必要なデータ出力に応じて[統合期間]を選択解除し、[ファイル]と[ムービーを開く]を選択して、以前に録画した各ビデオファイルをアップロードします。検出の単一領域を構築するには、円ツールを使用して、ワームが配置されている液体ドロップ全体の周りに領域を作成します。
選択した領域内のすべてのワームのアクティビティが検出されます。キャリブレーションまでの距離を指定するには、ビデオ領域の左から右に水平線を引き、[キャリブレーション]、[描画]、および[グループに適用]を選択します。分析対象となる C.elegans ワーム株をすべて検出できるようにするには、[領域]アイコンの選択を解除し、[アクティビティしきい値]で検出感度を調整します。
アクティビティ解析の進行中に動物が作成したトラックを視覚化するには、[表示スケール]を 70 に設定し、[グループに適用]を選択します。ビデオを分析するには、[再生] をクリックし、[実験] を選択し、[実行] を選択してビデオのファイル名を入力します。保存後、コンピュータの最大速度でビデオを分析するかどうかを尋ねるウィンドウが表示されます。
[はい] をクリックします。実行中の実験ウィンドウが開きます。[開始] をクリックします。
記録解析が完了したら、[実験] をクリックして停止し、分析したアクティビティをスプレッドシートのドロップレットに保存します。96ウェルプレート形式で液体培地中のC.elegans locomotor活性を分析するには、ワームがL4段階に達すると、クリア96ウェルフラットボトムマイクロプレートの各ウェルに大腸菌OP50およびS.基底培地の体積当たり2%重量の50マイクロリットルを加えます。実体顕微鏡を使用して、96ウェルプレートのウェルあたり15個の同期ワームを手動で選び、ワームが20分間順応できるようにします。
順応期間の終わりに、標準的なフラットベッドスキャナを使用して、スキャンの間に10秒未満で各マイクロプレートを2回スキャンする スキャンを分析するには、オープンソースソフトウェアを使用して2つのシーケンシャルスキャンを整列させ、2つの画像と相対ワームスキャンスコアの間のピクセル変更データを取得して、スキャナーがピクセルに設定したときに生成する光強度に基づいて運動応答の変化を決定します。5のしきい値。液体培地の一滴でのC.elegans loco運動活性のこの分析では、ミトコンドリア複合体I病虫は、野生型ワームと比較してL4段階でのロコモ運動活性の有意な38%の減少を示した。同様に、同じ集団のワームスキャン分析は、N2ブリストル野生型ワームと比較して、L4段階疾患モデルワームの運動活動の有意な減少を示した。
この機関車の活動損失は、ワームスキャン分析によって評価される成人1日目のミトコンドリア複合体I病虫においても観察された。各アッセイをセットアップする際には、正しい数のワームを使用することを忘れないでください。この手順に従って、私たちの研究室は頻繁に薬物スクリーニングを行います。
この2つの技術は、ミトコンドリア病の前臨床動物モデルにおけるワーム活性に対する関心のある薬物の影響を評価するために当研究室で使用されています。
