Bu protokol, sıvı ortamda C.elegans lokomotor aktivitesini hızlı bir şekilde ölçmek için iki farklı yarı otomatik test kullanır ve C.elegans hastalık modellerinde ilaç taraması için uygulanma potansiyeline sahiptir. Bu iki tekniğin temel avantajları kullanım kolaylığı ve tekrarlanabilirlik kolaylığıdır. Her iki teknik de solucan davranışı üzerindeki ilaç etkilerini değişken aktarım hızı ile değerlendirme potansiyeline sahiptir.
Bu hareketlilik tahlilleri, hayvanların nöromüsküler sisteminin bozulduğunda C.elegans mitokondriyal hastalık modellerinin lokomotor aktivitesini değerlendirmek için yararlıdır. L4 aşamasına ilgi çekici ilaç tedavileri olan ve olmayan NGM plakalarındaki mutant solucan suşlarında kontrolü senkronize ettikten sonra cam slaytlardaki sıvı ortamda C.elegans lokomotor aktivitesini analiz etmek için, bir solucan seçimi ve stereomikroskop kullanarak suş başına beş solucan ve koşul olarak cam bir slayttaki S.bazal çözeltinin 20 mikroliter damlasına alın. Birden fazla teknik çoğaltma elde etmek için aynı slayttaki birden çok damlacık için farklı NGM plakalarından aynı deneysel durumdan solucanlar ekleyin.
Tüm solucanlar toplandığında, solucanların her damlada bir dakika boyunca damla başına saniyede 15 karede yüzme aktivitesini kaydetmeden önce hayvanların oda sıcaklığında bir dakika boyunca kaydırağa alışmasına izin verin. ZebraLab yazılımını kullanarak kaydedilen C.elegans lokomotor etkinliğini analiz etmek için zebralab AVI seçeneğini kullanarak yazılıma video yükleyin. AVI Dosyalarıyla Niceleme seçeneğini tıklatın.
Yeni bir iletişim kuralı oluşturmak için Parametreler, Protokol Parametreleri ve Zaman'ı seçin ve deneme süresini bir dakika olarak ayarlayın. Zaman Kutusu Yok'u seçin ve istenen veri çıktısına göre Tümleştirme Dönemi'nin seçimini kaldırın ve daha önce kaydedilmiş her bir video dosyasını yüklemek için Dosya ve Film Aç'ı seçin. Tek bir algılama alanı oluşturmak için, solucanların bulunduğu tüm sıvı damlasının etrafında bir alan oluşturmak için daire aracını kullanın.
Seçilen alandaki tüm solucanların etkinliği algılanacaktır. Kalibre etme mesafesini belirtmek için video alanının solundan sağuna yatay bir çizgi çizin ve Kalibrasyon, Çiz ve Gruba Uygula'yı seçin. Tüm farklı C.elegans solucan suşlarının algılanmasının analiz edilmesine izin vermek için Alan simgesinin seçimini kaldırın ve Etkinlik Eşiğindeki Algılama Duyarlılığı'nı ayarlayın.
Etkinlik analizi devam ederken hayvanlar tarafından yapılan parçaları görselleştirmek için Ekran Ölçeği'ni 70 olarak ayarlayın ve Gruba Uygula'yı seçin. Videoları çözümlemek için Oynat'ı tıklatın ve Deney'i seçin ve videonun dosya adını girmek için Yürüt'ü seçin. Kaydettikten sonra, videonun maksimum bilgisayar hızında analiz edilip edilmeyeceğini soran bir pencere görünecektir.
Evet'i tıklatın. Çalışan deneme penceresi açılır. Başlat'ı tıklatın.
Kayıt analizi tamamlandığında, damlacıkta analiz edilen etkinliği bir elektronik tabloya kaydetmek için Deneme ve durdur'a tıklayın. C.elegans lokomotor aktivitesini sıvı ortamda 96 kuyulu bir plaka formatında analiz etmek için, solucanlar L4 aşamasına ulaştığında, açık bir 96 kuyu düz alt mikro plakanın her kuyusuna E.coli OP50 ve S.bazal ortamı hacmi başına% 2 ağırlıkta 50 mikrolitre ekleyin. Stereomikroskopu kullanarak 96 kuyu plakasının kuyusu başına 15 senkronize solucanı manuel olarak seçin ve solucanların 20 dakika boyunca alışmasını bekleyin.
Alışma süresinin sonunda, taramalar arasında 10 saniyeden az bir süre ile her mikro plakayı iki kez taramak için standart bir düz yataklı tarayıcı kullanın Taramaları analiz etmek için, iki sıralı taramayı hizalamak ve tarayıcının bir piksele ayarlandığında ürettiği ışık yoğunluğuna göre lokomotor yanıtındaki değişiklikleri belirlemek için iki ardışık taramayı hizalamak ve iki görüntü ile göreli solucan tarama puanı arasındaki piksel değiştirme verilerini almak için açık kaynaklı yazılım kullanın eşiği beştir. Tek bir sıvı ortamdaki C.elegans lokomotor aktivitesinin bu analizinde, mitokondriyal kompleks I hastalığı solucanları, L4 aşamasındaki lokomotor aktivitelerinde vahşi tip solucanlara kıyasla önemli bir% 38 azalma göstermiştir. Benzer şekilde, aynı popülasyonların solucan tarama analizi, L4 evre hastalık modeli solucanları için N2 Bristol vahşi tip solucanlara kıyasla lokomotor aktivitesinde önemli bir azalma olduğunu göstermiştir.
Bu lokomotif aktivite kaybı, solucan tarama analizi ile değerlendirilen yetişkin bir evre mitokondriyal kompleks I hastalığı solucanlarında da gözlenmiştir. Her tahlil kurarken doğru sayıda solucan kullanmayı hatırlamak önemlidir. Bu işlemi takiben laboratuvarımız sık sık ilaç taraması gerçekleştirmektedir.
Bu iki teknik laboratuvarımızda mitokondriyal hastalığın preklinik hayvan modellerinde ilgi çekici ilaçların solucan aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılmaktadır.
