이 프로토콜은 액체 매체에서 C.elegans 운동 활동을 신속하게 정량화하기 위해 두 개의 서로 다른 반자동 분석약을 사용하며 C.elegans 질병 모델에서 약물 스크리닝에 적용 될 가능성이 있습니다. 이 두 기술의 주요 장점은 사용의 용이성과 재현성의 용이성입니다. 두 기술 모두 가변 처리량으로 웜 동작에 대한 약물 효과를 평가할 수 있습니다.
이러한 운동성 작용은 동물의 신경근육 시스템이 손상된 C.elegans 미토콘드리아 질환 모델의 운동 활성을 평가하는 데 유용합니다. L4 단계에 대한 약물 치료 없이 NGM 플레이트의 돌연변이 벌레 균주에서 제어를 동기화한 후 유리 슬라이드에서 액체 배지에서 C.elegans 운동 활성을 분석하려면 웜 픽과 스테레오 현미경을 사용하여 스트레인당 5개의 웜과 상태를 유리 슬라이드에 S.basal 솔루션의 개별 20 마이크로리터 방울로 선택합니다. 여러 기술 복제를 얻기 위해 동일한 슬라이드의 여러 방울에 다른 NGM 플레이트에서 동일한 실험 조건에서 웜을 추가합니다.
모든 벌레가 수집되면, 동물이 낙하당 당 초당 15 프레임에서 1 분 동안 각 드롭에서 수영 활동을 기록하기 전에 실온에서 1 분 동안 슬라이드에 적응할 수 있습니다. ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 기록된 C.elegans 운동 활동을 분석하려면 ZEBRALAB AVI 옵션을 사용하여 소프트웨어를 업로드합니다. AVI 파일 옵션을 통해 양자화를 클릭합니다.
새 프로토콜을 만들려면 매개 변수, 프로토콜 매개 변수 및 시간을 선택하고 실험 기간을 1분으로 설정합니다. 원하는 데이터 출력에 따라 시간 없음 빈을 선택하고 통합 기간을 선택 취소하고 이전에 녹화된 각 개인을 업로드하기 위해 파일 및 동영상을 엽니다. 단일 감지 영역을 구축하려면 원 도구를 사용하여 웜이 있는 전체 액체 낙하 주위에 영역을 만듭니다.
선택한 영역 내의 모든 웜의 활동이 감지됩니다. 보정거리를 나타내려면 비디오 영역의 왼쪽에서 오른쪽으로 가로선을 그리고 교정, 그리기 및 그룹에 적용합니다. 모든 다른 C.elegans 웜 균주를 분석할 수 있도록 영역 아이콘을 선택 해제하고 활동 임계값에서 검출 감도를 조정합니다.
활동 분석이 진행되는 동안 동물이 만든 트랙을 시각화하려면 디스플레이 축척을 70으로 설정하고 그룹에 적용을 선택합니다. 동영상을 분석하려면 재생을 클릭하고 실험을 선택하고 실행에 따라 동영상의 파일 이름을 입력합니다. 저장 후 최대 컴퓨터 속도로 비디오를 분석할지 여부를 묻는 창이 나타납니다.
예를 클릭합니다. 실행 중인 실험 창이 열립니다. 시작을 클릭합니다.
기록 분석이 완료되면 실험을 클릭하고 중지하여 스프레드시트의 액적에서 분석된 활동을 저장합니다. 96웰 플레이트 형식으로 액체 배지에서 C.elegans 운동 활성을 분석하려면 웜이 L4 단계에 도달하면 E.coli OP50 및 S.basal 배지의 부피당 2%의 마이크로리터 50마이크로리터를 명확한 96웰 의 평평한 바닥 마이크로플레이트에 추가합니다. 스테레오현미경을 사용하여 96웰 플레이트의 웰당 15개의 동기화된 웜을 수동으로 선택하고 웜이 20분 동안 적응할 수 있도록 합니다.
적응 기간이 끝나면 표준 평판 스캐너를 사용하여 스캔 사이에 10초 미만으로 각 마이크로플레이트를 두 번 스캔하여 스캔을 분석하고, 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 두 개의 순차 스캔을 정렬하고, 두 개의 이미지와 상대 웜 스캔 점수 사이의 픽셀 변경 데이터를 획득하여 스캐너가 픽셀로 설정할 때 생성된 광 강도에 따라 운동 반응의 변화를 결정합니다. 임계값은 5입니다. 이러한 분석에서 액체 배지의 한 방울에서 C.elegans 운동 활성을 분석하여, 미토콘드리아 복합 I 질환 웜은 야생형 웜에 비해 L4 단계에서 의 운동 활동이 현저한 38% 감소를 보였다. 유사하게, 동일한 집단의 웜 스캔 분석은 N2 Bristol 야생 형 웜에 비해 L4 단계 질병 모델 웜에 대한 운동 활성이 현저한 감소를 보였다.
이러한 기관차 활동 손실은 또한 웜 스캔 분석에 의해 평가된 바와 같이 성인 1단계 미토콘드리아 복합I 질환 웜에서 관찰되었다. 각 분석기를 설정할 때 올바른 수의 웜을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 우리의 실험실은 자주 약물 검사를 수행.
이 두 가지 기술은 미토콘드리아 질환의 전임상 동물 모델에서 웜 활동에 대한 관심있는 약물의 효과를 평가하기 위해 실험실에서 사용됩니다.
