穀物および豆類の遊離可溶性フェノール酸組成および抗酸化能を決定するための一般化された方法。穀物や豆類を含む全粒穀物は、人間の食事のかなりの部分を占めています。人間に対するそれらの栄養学的関連性は長い間認識されてきました。
しかし、より最近では、それらの抗酸化保護健康上の利点が報告されている。穀物の外粒層および豆類の種皮に見られるフェノール酸は、全粒穀物の抗酸化特性に寄与する。彼らは生体分子に酸化的損傷を引き起こすフリーラジカルを捕捉する。
全粒穀物に含まれるフェノール酸の2つのクラスは、ヒドロキシ安息香酸およびヒドロキシ桂皮酸である。この研究は、全粒穀物フェノール酸を抽出し、それらのin vitro抗酸化能力を決定するための簡単な方法を提供する。この研究には、デュラム小麦、イエローコーン、黒目ササゲ豆、大豆、赤インゲン豆の5つの全粒穀物サンプルを使用します。
全粒粉サンプル100ミリグラムを、琥珀色の2ミリリットル容量のマイクロ遠心管に直接正確に計量します。チューブの暗い色は、混合物が光にさらされるのを防ぐのに役立ちます。実施例を含む各チューブに1ミリリットルの80%メタノール水溶液を加える。
ボルテックスはメタノール溶液と試料とを短時間混合する。サンプルを60分間超音波処理して、遊離の可溶性フェノール化合物を抽出します。光からの追加の保護のための超音波処理の期間中、サンプルの上にカバーを置きます。
超音波処理後、混合物を20、000倍Gで5分間遠心分離し、固体残渣を沈降させ、上清を上に残します。遊離フェノール化合物は、遠心分離後の上清中に存在するであろう。上清は、HPLC装置に注入する前に濾過する必要があります。
上清をろ過するには、3mLシリンジのプランジャーを取り外し、シリンジフィルターを取り付けます。フィルターの孔径は 0.22 マイクロメートル以下でなければなりません。約0.4ミリリットルの上清をシリンジの上部にピペットする。
プランジャーを再挿入し、フィルターを通して液体をバイアルインサートを含むHPLCバイアルに押し込みます。HPLC分析用の原稿に概説されている方法を実行するように機器がセットアップされたら、サンプルリストに対応するようにバイアルをカルーセルにロードします。320ナノメートルおよび280ナノメートルでHPLCクロマトグラムを取得し、異なるフェノール化合物を表す別個のピークを示す。
適切な標準曲線を使用して、ヒドロキシ桂皮酸は、この波長で最大の吸光度を有するので、320ナノメートルで定量する。同じ原理により、ヒドロキシ安息香酸類を280ナノメートルで定量する。ビタミンEの水溶性類似体であるトロロックスを標準として使用して、全粒穀物抽出物のインビトロ抗酸化能を推定する。
正確にファルコンチューブにトロロックスの1ミリグラムを計量します。4ミリリットルの50%メタノール水溶液で溶解し、1リットルあたり1ミリモルの原液を調製し、これは1リットルあたり1000マイクロモルと同じである。1リットルあたり50、100、200、400、600、および800マイクロモルの6つの濃度のトロロックスを準備して、DPPHラジカル消去能力およびトロロックスと同等の抗酸化能(TEACの推定のための標準曲線をプロットする。
同様に、酸素ラジカル吸光度容量(ORAC)を推定するために、1リットルあたり6.25、12.5、25、および50マイクロモルのトロロックス濃度を準備する。表1に示すように、各濃度の総容量を500マイクロリットルに構成する。分析前にサンプル抽出物をメタノールで希釈する。
ここで、イエローコーン及びササゲ抽出物を2倍に希釈した。小麦およびインゲン豆抽出物を5倍に希釈し、一方、大豆抽出物をメタノールで10倍希釈した。8.23ミリグラムのABTSを清潔で2ミリリットルの容量の琥珀色のマイクロ遠心管に入れます。
次に、1.62ミリグラムの過硫酸カリウムを清潔で2ミリリットルの容量の琥珀色のマイクロ遠心管に入れます。秤量した薬品のそれぞれをボルテックスにより1ミリリットルの蒸留水に溶解する。これは、16ミリモルのABTS溶液および6ミリモルの過硫酸カリウム溶液をもたらす。
ABTSと過硫酸カリウム溶液とを等量混合してABTS原液を調製する。解決策はすぐに暗い色に変わります。この混合物を暗闇の中で12〜16時間インキュベートさせる。
ABTSストック溶液を200ミリモルのリン酸緩衝生理食塩水で30倍に希釈し、ABTS作業溶液を形成した。これを行うには、2ミリリットルのABTS作業溶液に58ミリリットルの200ミリモルPBSを加える。作業溶液は、0.27ミリモルABTSおよび0.1ミリモル過硫酸カリウムを含有する。
分析のために、各希釈抽出物の10マイクロリットルを96ウェルマイクロプレートに入れる。190マイクロリットルのABTS作業溶液を各ウェルに加え、60分間インキュベートする。マイクロプレートリーダーで750ナノメートルでの反応混合物の吸光度を測定する。
1リットルあたり100~800マイクロモルの範囲の濃度のTrolox標準を使用して、検量線をプロットします。DPPH抗酸化アッセイには、ラジカル生成化合物DPPHが必要です。空の15ミリリットル容量の遠沈管に1.2ミリグラムのDPPHを計量します。
DPPHをメタノールに溶解し、60マイクロモルの溶液を調製した。DPPHアッセイは、DPPHによって生成されたフリーラジカルを捕捉するサンプル抽出物の能力を試験する。5マイクロリットルのサンプル抽出物をマイクロプレートウェルに加える。
次に、195マイクロリットルの60マイクロモルDPPHメタノール溶液を添加し、60分間インキュベートする。515ナノメートルでの吸光度を測定する。Trolox標準を使用して検量線をプロットします。
図1は、全粒穀物に見られるヒドロキシ安息香酸類の構造を示す。この現在の研究では、バニリン酸が同定された唯一のヒドロキシ安息香酸であった。図2は、全粒穀物に見られるヒドロキシ桂皮酸の構造を示す。
現在の研究では、p-クマル酸、カフェ酸、およびフェルラ酸がサンプル中に同定された。表2は、試料中で同定されたフェノール酸を示す。前述のように、バニリン酸はサンプルで同定された唯一のヒドロキシ安息香酸でした。
ササゲ抽出物のみで同定した。ヒドロキシケイ皮酸カフェ酸はインゲン豆でのみ同定されたが、p-クメリン酸はイエローコーン、ササゲ、および大豆において同定された。フェルラ酸はすべてのサンプルで同定され、サンプル中の優勢なフェノール酸でした。
フェノール酸類の総濃度は、最大から最小の順に、大豆、ササゲ、イエローコーン、およびインゲン豆または同等物の順に、次いで小麦であった。表3は、試料の総フェノール含有量および抗酸化能を示した。抗酸化能は、DPPHラジカル消去能、TEAC、ORAC、および試料の総抗酸化能から構成されていた。
総抗酸化能は、DPPH、TEAC、およびORAC値の合計です。表2と同様に、大豆は総抗酸化能が最も高かった。しかし、ササゲの代わりに、ササゲの総フェノール酸含有量が2番目に高いにもかかわらず、総抗酸化能力が2番目に高いのはむしろインゲン豆でした。
この異常は、個々のフェノール酸の構造およびササゲのヒドロキシ桂皮酸の抗酸化効果に対するヒドロキシ安息香酸バニリン酸の可能な拮抗効果に関連している。この研究は、全粒穀物がフェノール酸組成において異なると結論付けた。研究された全粒穀物の中で、大豆はフェノール酸の総量が最も多く、それに対応して抗酸化能が最も高い。
