このプロトコルの目的は、半標的UPLC-MS/MS法によって血漿中のフェノール代謝産物を検出することです。血漿タンパク質をエタノールで沈殿させ、サンプルを濃縮し、UPLC装置に注入する前に移動相に再懸濁した。化合物は、ラボで組み立てられた半標的ライブラリー、メタボロミクス、ソフトウェア、および異なる無料のオンラインデータベース用のPCDLマネージャーを使用して同定された。
我々は、ブロシムム・アリカストラム種子粉で調合されたマフィンと飲料による栄養介入を実施しました。介入の終わりに、参加者の栄養状態およびサルコペニック状態が改善され、血漿の総フェノール含有量が増加した。しかし、どのフェノール化合物が吸収され、肯定的な効果に貢献したかを特定する必要があります。
これらの抗酸化物質が豊富な食品の消費後に吸収されるフェノール化合物の同定および定量は、これらの植物化学物質の生物学的活性を実証する場合、困難な作業であるが、必要である。ほとんどのフェノール成分の生物学的利用能は低く、さらにそれらの5%未満が血漿への構造変換なしで入る。ほとんどは、メチル化、スルホン化、またはグルクロン酸抱合などのいくつかの生体内変換を経る。
幅広い研究により、UPLC-MSおよびUPLC-MS/MSによって生体流体中の最も一般的な代謝産物が同定された。しかし、細菌代謝産物の大部分は、それらの完全な情報を含むデータベースの欠如に報告されていない。代謝産物の同定は、代謝産物標準のコストおよび商業的入手可能性によって複雑になる。
したがって、最良の戦略は、非標的または半標的MS/MS代謝産物分析であり得る。この分析は、分子特徴情報、質量電荷比モノアイソトピックの正確な質量、同位体分布、およびフラグメンテーションパターンの使用に依存しています。化学的同一性を決定し、ポリフェノールが豊富な食事の消費後に生体液中に同定されたポリフェノール代謝産物を含む無料の利用可能なオンラインデータベースと比較する。
本研究では、栄養介入に関与する高齢者群の血漿サンプルを分析するための半標的UPLC-MS/MS法を開発しました。分析まで血漿サンプルをマイナス80°Cで保存します。プラズマサンプルを室温で15分間、または摂氏37度で5分間解凍します。
200マイクロリットルの血漿サンプルを2ミリメートルのマイクロチューブに入れ、1000マイクロリットルの純粋なエタノールと混合する。ボルテックスプラズマ試料を30秒間処理した。6、580遠心力で5分間の遠心機サンプル。
遠心分離後、マイクロピペットまたはパスツールピペットで上清を収集し、新しいマイクロチューブに入れます。上清を予約する。ペレットを1000マイクロリットルの純粋なエタノールと混合し、頂点を30秒間、次いで同じ条件で遠心分離する。
上清を集め、最初の上清と混ぜる。135psiで純窒素を使用してサンプルからエタノールを除去する。マイクロチューブの上部から針を1センチ離してサンプルの損失を防ぎ、サンプルが乾くまで洗い流してください。
乾燥試料を100マイクロリットルの1つに再懸濁し、アセトニトリルと水との混合物を1つにすることである。45マイクロナイロンシリンジメンブレンを通してHPLCバイアルマイクロインサートに直接フィルターをかけ、C 18逆相カラムを備えたUPLCに3マイクロリットルのサンプルを注入します。オートサンプラーの温度を摂氏 20 度に設定し、カラムのサーモスタットを摂氏 25 度に設定します。
各サンプルを3連で注入する。溶媒Aとして水中の0.1%ギ酸を使用し、溶媒Bとして100%アセトニトリルを使用し、流量を毎分0.4ミリメートルに設定し、以下のように勾配プログラム、0〜1分10%B、1〜4分30%B、4〜6分38%B、6〜8分60%B、8〜8.5分60%B、 質量分析計を負モードイオン化に設定し、10%B.
窒素を300°Cで乾燥ガスとして使用し、流量を毎分13リットルで使用します。ネブライザーの圧力を 30 psi に設定します。キャピラリー電圧を4,000ボルト、フラグメンタ電圧を175ボルト、スキマー電圧を65ボルトに設定します。
100 ~ 1100 m/z の質量をスキャンし、質量分析では 50 ~ 1000 m/z の質量をスキャンします。データ集録を自動MS/MSモードに設定します。次の参照質量 119.036 および 966.0007 を使用します。
フェノール化合物、フェノール代謝産物、および科学文献で関心のある他の化合物を検索します。UPLCシステムに含まれているデータベース管理ソフトウェアを開きます。ファイルを選択してから、新規個人データベース複合ライブラリー PCDL を選択します。
次に、新しい PCDL を作成するを選択します。PCDL LC/MS メタボロミクスの種類を選択します。PCDL の名前を設定します。
次に、[作成] を選択します。ツールバーで、[PCDL] を選択し、[編集を許可する] オプションを選択します。次に、[化合物を検索]ボタンをクリックします。
コンパウンドは、2つの方法で個人ライブラリに追加でき、まず楽器の一般ライブラリからコピーします。これを行うには、これまでのデータ管理に含まれていた計測器の既存のデータベースを開きます。「化合物を検索」ボタンをクリックします。
単一検索オプションに複合検索基準を入力して、目的の複合を検索します。化合物結果表で、目的の化合物を選択します。複数の化合物を選択するには、最初の化合物をクリックし、Ctrl キーを押しながら、目的の各化合物をクリックします。
次に、強調表示されたすべての化合物を右クリックし、[PCDLに追加]を選択します。新しいウィンドウで、特殊なパーソナル・データベース・ファイルを検索して選択します。化合物が存在する場合は、そのスペクトルを含むボックスにマークを付けます。
「追加」ボタンをクリックします。新規ダイアログボックスで、「はい」を選択して、追加された新規コンパウンドをチェックします。[いいえ] を選択して、関心のあるコンパウンドをさらに検索し続けます。
第2に、新しい化合物は、機器の一般ライブラリで利用できない場合、手動で追加できます。このオープンのために、特殊なパーソナルデータベース。開いたら、[PCDL] を選択し、[編集を許可する] オプションを選択します。
「コンパウンドを編集」オプションを選択します。[新規追加] ボタンをクリックします。ウィンドウの上部セクションで、新しいコンパウンドの情報を入力します。
式、名前、IUPAC名、CAS番号、ケムスパイダーID、およびその他の識別子を入力します。無料のオンラインライブラリ、Chemspider、PubChem、およびフェノールエクスプローラで利用可能な情報を使用して、関心のある新しい化合物の情報を記入します。完了したら、[新規として保存]ボタンをクリックして、新しい複合情報を特殊なパーソナルデータベースに保存します。
目的のすべての化合物でこのプロセスを繰り返して、特殊なパーソナルデータベースを完成させます。機器の定性管理ソフトウェアを使用して、フェノール化合物とフェノール代謝産物を同定します。サンプル ファイルを開きます。
クロマトグラムパネルで、クロマトグラムの定義を選択し、トータルイオンクロマトグラムTICを抽出し、MS EICのイオンクロマトグラムを抽出し、MS/MSのEICを抽出します。クロマトグラムの統合オプションを選択します。[化合物を検索] パネルで、[数式で検索] オプションを選択します。
新しいウィンドウで、数式ソースを選択し、次にデータベーススラッシュライブラリオプションを選択します。以前に作成したパーソナルデータベースを見つけて、[開く]をクリックします。フォーミュラマッチングオプションを選択し、マスマッチ公差を5ppmに設定します。
マイナスイオンオプションを選択し、マイナスHダイアログボックスのみを選択します。結果オプションで、抽出EICをマークし、クリーンアップされたスペクトルを抽出し、生のスペクトルを抽出し、構造化されたダイアログボックスを含めます。[結果フィルター] オプションを選択します。
次に、スコアが一致している場合に警告マークを付け、次にスコア一致を80%に設定し、スコアが一致しない場合にマークを付け、スコアを75%に設定してから、式で化合物を検索をクリックして、サンプル中の目的の化合物を同定します。血漿サンプルの半標的UPLC MS/MS分析によるフェノール代謝産物の同定のためのステップバイステッププロセスを次の図に示す。まず、無料のオンラインデータベースから得られた645のフェノール化合物とその代謝産物を含む自己作成PCDLデータベースを使用して、総イオンクロマトグラムを取得しました。
次に、抽出したイオンクロマトグラム及びフラグメンテーションパターン、又はイオンを5ppm未満の質量で、一致許容差が得られた。最後に、検出されたピークの同位体分布を理論化合物の同位体分布と比較した。この分析から、血漿サンプル中に合計25のフェノール化合物および代謝産物が同定された。
吸収フェノール化合物またはその代謝産物の同定における設計方法の有効性を評価するために、30日間の介入の前後に得られた研究参加者の5つのサンプルを分析した。各化合物の相対存在量は、処理後の曲線下面積を処理前のAUCで割ることにより算出した。表4は、ブロシム・アリカストルム粉含有食品の30日間の消費後に血漿の増加を示した12個のフェノール化合物のリストを示す。
フェニル酢酸は、処理後により高い濃度で一貫して見出された代謝産物のみであった。グリシチン、グリコシル化イソフラボン、および3つのヒドロキシフェニル吉草酸は、5つのサンプルのうち3つで増加したが、他の2つでは減少した。リグナンであるゴミシンM2は、栄養介入後にのみ5つのサンプルのうち3つで検出された。
他のフェノール化合物および代謝産物は、1つのサンプルにおいてのみ、および処理後にのみ見出された。この方法は、現在の論文を開発し、ほとんどの部分において、それが作成された目的によく適していたことを示している。1処置あたりのサンプルは簡単で効果的であった。
UPLC分離およびフェノール代謝産物の半標的MS/MS同定が達成された。
