このプロトコルは、血管形成の多くの特徴を再現し、薬物の試験に使用できるin vitro発芽血管新生アッセイについて説明しています。この方法は、ラボで簡単に実装でき、堅牢でスケーラブルです。ヒトリンパ管内皮細胞やミクロスフェアを用いたアッセイと多くの類似点があります。
このモデルは、病理学的血管新生につながる内皮先端細胞選択および配向内皮細胞移動の欠陥を示す表現型を頑健に模倣する。今回の研究は、特に遺伝子スクリーニングを行うことにより、発芽血管新生を調節する機構、重要な遺伝子、および関与するシグナル伝達経路に関する手掛かりを得ることができる。 主な課題は、培養中のマウス胚性幹細胞の品質または多能性を維持することである。細胞株の多能性段階と形態を定期的にチェックすることが重要です。
また、細胞株は染色体を失ったり獲得したりするために培養する傾向があるため、細胞株の核型決定を行うことも重要です。まず、6ウェル細胞培養プレートの1ウェルを500マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液でコーティングし、二酸化炭素インキュベーターに30分間入れます。次に、ゼラチンコーティングされたプレートをPBSで洗浄し、500マイクロリットルの新たに調製したCMプラスマイナス培地を加えます。
マウス胚性幹細胞またはmESCの純粋な集団を得るには、細胞培養プレートを10x TVPバッファーで室温で30秒間トリプシン処理します。次に、細胞を1ミリリットルの中胚葉分化培地に再懸濁してから、ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートに30分間移し、mESCが懸濁状態にある間にマウス胚性線維芽細胞を付着させます。トリパンブルー色素のノイバウアー血球計算盤を使用して生細胞をカウントする前に、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。
次いで、細胞を200倍Gで室温で5分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを適量の中胚葉分化培地に再懸濁する。底に15ミリリットルの滅菌水を加えて、4つの94ミリメートルの低アタッチメントポリスチレン皿を準備します。
細胞懸濁液を滅菌プラスチックリザーバーに移した後、マルチチャンネルピペットの4つの位置に、チャンネルあたり22マイクロリットルの細胞懸濁液をロードします。94 mm 皿の逆さにした蓋を持ち上げて、内側を上に向けてフローキャビネットのきれいな面に置きます。各蓋の内面に40滴の細胞懸濁液を堆積させ、滴が水に面するように、蓋を邪魔することなく慎重にひっくり返して皿に戻します。
これを分化ゼロ日と見なして、二酸化炭素インキュベーターで皿を4日間インキュベートします。4日間のインキュベーションの後、P1000ピペットを使用して15ミリリットルの円錐形のチューブにぶら下がっている滴を集めます。上清を除去する前に、EB沈殿物をチューブに入れてください。
EBを3ミリリットルの2x血管分化培地に再懸濁してから、EB懸濁液を60ミリメートルの寒天コーティングディッシュに移し、均一に分配します。2日ごとに中程度のリフレッシュで9日目まで二酸化炭素インキュベーターで皿をインキュベートします。底部に1ミリリットルの発芽培地を加えて、35ミリメートルの培養皿を準備します。
ゲル化を誘発するには、皿を摂氏37度で5分間インキュベートします。15ミリリットルの円錐管に1つの寒天皿から9日齢のEBを集め、上清を取り除きます。EBを2ミリリットルの冷発芽培地に再懸濁し、発芽培地の第1層をコーティングした培養皿に移します。
EBをプレート全体に分散させ、互いに等しい距離にあることを確認します。最初の芽の形成は、約24〜48時間のインキュベーション後に明らかになるはずです。12日目に、スパチュラを使用して、EBを含むコラーゲンゲルをスライドガラスに注意深く移します。
ピペットで余分な液体を取り除き、ナイロンリネンのガーゼシートと吸収性フィルターカードをゲルの上に置いてゲルを脱水します。250グラムの重さで2分間圧力をかけます。次に、ナイロン紙を取り除き、スライドを室温で30分間風乾させます。
乾燥後、亜鉛溶液を使用してEBを摂氏4度で一晩固定します。翌日、PBSでスライドを5回洗浄する前に、固定液を取り外してください。0.1%トリトンX-100を含むEBおよびPBSを透過処理します。
15分後、透過処理液を取り出し、スライドをPBSで5分間5回洗浄する。EBをブロッキングバッファー中で室温で1時間インキュベートし、PBSで5分間洗浄します。次に、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体を加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。
次に、スライドをヤギ抗ラットAlexa 555二次抗体とともにブロッキングバッファー中で室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、顕微鏡検査用にマウントする前に、スライドをPBSで5分間3回、水で1回洗浄します。3D発芽血管新生アッセイは、DC101およびDAPTの2つの薬剤を含む3つのEBで実施されました。
両方の化合物は、濃度の増加とともにEBモデルにおける血管新生を徐々にブロックした。EB中の薬物の様々な濃度は、高用量のDC101が血管芽の数および長さを阻害することを示した。DAPTは、1リットルあたり1マイクロモルの用量で反対の効果を示しました。.
DAPTは、DC101と比較して、低用量でも誤ったガイダンス表現型を有する血管芽あたりの内皮先端細胞数を強力に増加させた。ACVRL1コントロールおよびACVRL1ヘテロ接合型遺伝子型の遺伝性出血性毛細血管拡張症EBでは、親血管に対してランダムな角度で発芽する多数の誤った誘導表現型で血管発芽の欠陥が観察されました。野生型mESC株と非標識mESC野生型株との1対1の比率での混合物は、主要な内皮先端細胞への同等の寄与をもたらした。
この代表的なキメラEBの顕微鏡分析を行い、主要な内皮先端細胞の遺伝子型起源を同定した。血管芽の壁細胞被覆率を定量化するために、EBを固定し、内皮細胞マーカーであるPECAMおよび壁細胞マーカーであるアルファ平滑筋アクチンについて染色した。高倍率画像は、1つの個々の血管芽が壁画細胞に囲まれていることが明らかになりました。
二項形質転換は、カラーチャネル分離後に行い、アルファSMA陽性壁画細胞で覆われたPECAM陽性血管の比率を定量化した。胚性幹細胞株の遺伝的背景も、一部の系統が他の系統よりも発芽するため、研究者が考慮しなければならない重要な要素です。この方法は、RNAiアプローチまたは遺伝子変異を有するマウス胚性幹細胞のバンクを用いた遺伝子スクリーニングを行うことができる。
