シャトルボックスアッセイは、ゼブラフィッシュの鈍い力の外傷または他のタイプの脳損傷に続く認知障害の進行と回復を再現的に追跡します。シャトルボックスアッセイは、ゼブラフィッシュの短期記憶と長期記憶の両方で、比較的簡単で迅速かつ堅牢な連想学習の測定を可能にします。まず、30.5 x 19 x 7.5センチメートルのゲルボックスを修正し、5 x 19センチメートルの水槽グレードのプレキシガラスを45度の角度で両側に加えてシャトルボックスを準備します。
その後、魚がタンクの真ん中を横切ったときを評価するために、タンクの中間点を示すラインを作ります。シャトルボックスに800ミリリットルのシステム水を加えた後、2~3匹の魚をシステム水を含む保持タンクに入れます。シャトルボックスアッセイが行われる暗い部屋にタンクを残します。
次に、暗い部屋で、シャトルボックスの中央に1匹の魚を置きます。蓋を固定し、電極を電源に取り付けます。魚は暗闇の中で順応する必要があります。
すべてのライトを消し、15分間シャトルボックスに魚を順応させます。魚が自由にタンクを探索するときに成功した順応を考慮することができます。魚の順応に成功した後、手動で魚が占める側のゲルボックスの壁から約2センチメートルの800ルーメン赤いレンズ懐中電灯を輝かせる。
魚が白金ワイヤーの隣で休んでいる場合は、試験を開始しないでください。魚に直接光刺激を照らし、手動で刺激の継続的な可視化を確保するために、光と魚の任意の横の動きに従ってください。成功または失敗したトライアルに対して次のいずれかの条件が満たされるまで、光刺激を提供し続けます。
魚が光暴露の15秒以内にタンクの中間点を横切る場合、試験は成功したことを考えてみましょう。魚が中間点を越えたら、すぐに光刺激を止めます。試験が失敗した場合は、電気泳動電源を使用して20ミリボルトの負の衝撃刺激を1アンペアに適用し、2秒間交互に、最大4つの衝撃で15秒間2秒間オフにするか、魚が箱の中間点を通過するまで。
その後、光と陰性刺激の両方を終了します。訓練期間の前に、15分間暗い条件下で魚を残すことによってシャトルボックスへの正常な順応を確認してください。その後、手動で魚が占める側のゲルボックスの壁から約2センチメートルの800ルーメン赤いレンズ懐中電灯を輝かせます。
魚に直接光刺激を照らし、刺激の継続的な可視化を確実にするために、光と魚の任意の横の動きに従ってください。光が魚に輝いている間、同時に1アンペアに20ミリボルトの有害なショック刺激を適用し、2秒間交互に、最大4つの衝撃で15秒間オフに2秒、または魚が箱の中間点を通過するまで。これが達成されたら、光と有害な刺激を終了します。
25 回の繰り返しを繰り返します。完了すると、魚は暗い条件下で15分の別の順応期間を許可します。最初のテスト期間中、シャトルボックスで15分間順応を成功させ、光刺激のみを15秒間適用し、応答を記録します。
魚が光刺激を開始してから15秒以内にシャトルボックスの中間点を横切り、魚が中間点を横切ったときにすぐに光刺激を止める場合は、試験が成功したと考えてください。魚が光刺激を開始してから15秒後にシャトルボックスの中間点を越えない場合は、試行錯誤を検討し、15秒後に光刺激を停止します。最初のテストでは、試行に失敗した後に有害な刺激を適用しないでください。
最初のテスト期間の直後に、短期メモリテストを実行します。劇的な脳損傷を誘発し、テストの前に4時間の期間を待ちます.その後、シャトルボックスで魚を15分間順応させます。
最大15秒間光刺激のみを適用して短期記憶を評価し、魚がボックスの中間点を横切った場合、光が消灯するか、試験に合格したと見なされるか、または失敗した試験と見なされる15秒以内に中間点を通過しなかったかどうかを記録します。各試行の間に 30 秒の休息期間を使用して上記の手順を 25 回繰り返し、成功した試行と失敗した試行の数を記録します。最初のテストの 4 日後に長期メモリ テストを実行します。
外傷性脳損傷を誘発し、テストの前に4時間の期間待ってから、シャトルボックスで魚を15分間順応させます。最大15秒間光刺激のみを適用して長期記憶を評価し、魚がボックスの中間点を横切った場合、光が消灯するか、試験に合格したと見なされるか、または失敗した試験と見なされる15秒以内に中間点を通過しなかったかどうかを記録します。上記を繰り返し、各試行の間に30秒の休息期間を設定し、成功した試行数と失敗した試行回数を記録します。
認知評価のための学習と記憶パラダイムの説明の概要をここに示します。8ヶ月の損傷を受けていない魚、若い成人、18ヶ月、中年成人、および24ヶ月の高齢者は、赤信号を避ける行動を学ぶために同様の数の試験を必要としました。重度の鈍い力外傷性脳損傷モデル、またはSTBIを利用した後、異なる年齢の魚は、傷害後1〜5日間にわたってアッセイを習得するために同様の数の試験を必要としました。
STBIの次の1日目に、すべての年齢層の魚は、損傷していないコントロールよりも有意に大きい行動を学ぶために同様の数の試験を必要としました。損傷を受けていない魚は急速にシャトルボックスを習得し、約17回の試験で5回連続陽性試験を達成したのに対し、軽度の脳損傷、または軽度のTBIの翌日、魚は行動を学ぶために試験の数が大幅に増加した。この赤字は2つの軽度のTBIの後に増加し、3つの軽度のTBI傷害の後にさらに上昇した。
損傷を受けていない魚は、即時のメモリで成功した試験の割合差のわずかな増加を示し、最初のテスト期間に比べてメモリを遅らせる.単一の軽度のTBIに続いて, 魚は損傷していない魚と比較して重要かつ即時のメモリ不足を示しました.この傾向は、2つの軽度のTBIと3つの軽度のTBIの両方に続く赤字の増加と繰り返し傷害と続いた。
適用される有害な刺激のタイミングは重要です。有害な刺激と光と同時除去を組み合わせることで、その関連性が固まり、パラダイムにとって非常に重要です。このアッセイは、認知障害に対する発達、老化、環境への影響を調査するために使用できる迅速な評価または複雑な連想学習を可能にします。
