Der Shuttle Box Assay verfolgt reproduzierbar das Fortschreiten und die Genesung kognitiver Beeinträchtigungen nach einem stumpfen Krafttrauma oder einer anderen Art von Hirnverletzung bei Zebrafischen. Der Shuttle Box Assay ermöglicht eine relativ einfache, schnelle und robuste Messung des assoziativen Lernens sowohl im Kurz- als auch im Langzeitgedächtnis bei Zebrafischen. Bereiten Sie zunächst die Shuttle Box vor, indem Sie eine 30,5 x 19 x 7,5 Zentimeter große Gelbox mit einem 5 x 19 Zentimeter großen Stück Plexiglas in Aquarienqualität modifizieren, das auf jeder Seite in einem Winkel von 45 Grad hinzugefügt wird.
Machen Sie dann eine Linie, die den halben Weg des Tanks markiert, um zu beurteilen, wann Fische die Mitte des Tanks überquert haben. Nachdem Sie 800 Milliliter Systemwasser in die Shuttle Box gegeben haben, legen Sie zwei bis drei Fische in einen Auffangbehälter mit Systemwasser. Lassen Sie den Tank in dem dunklen Raum, in dem der Shuttle Box Assay durchgeführt wird.
Als nächstes legen Sie im dunklen Raum einen Fisch in die Mitte der Shuttle-Box. Befestigen Sie den Deckel und befestigen Sie die Elektroden an einem Netzteil. Der Fisch sollte im Dunkeln akklimatiert werden.
Schalten Sie alle Lichter aus und gewöhnen Sie den Fisch für 15 Minuten an die Shuttle Box. Eine erfolgreiche Akklimatisierung kann in Betracht gezogen werden, wenn der Fisch das Aquarium frei erkundet. Nach erfolgreicher Akklimatisierung der Fische leuchten Manuell eine 800 Lumen rote Linsen-Taschenlampe etwa zwei Zentimeter von der Gelkastenwand entfernt auf die vom Fisch besetzte Seite.
Starten Sie keinen Versuch, wenn der Fisch neben dem Platindraht ruht. Leuchten Sie den Lichtreiz direkt auf den Fisch und verfolgen Sie manuell jede seitliche Bewegung des Fisches mit dem Licht, um eine kontinuierliche Visualisierung des Reizes zu gewährleisten. Setzen Sie den Lichtreiz fort, bis eine der folgenden Bedingungen für eine erfolgreiche oder fehlgeschlagene Studie erfüllt ist.
Betrachten Sie den Versuch als erfolgreich, wenn der Fisch innerhalb von 15 Sekunden nach Lichteinwirkung die Hälfte des Tanks überquert. Sobald der Fisch die Hälfte des Wegs überquert hat, stoppen Sie den Lichtreiz sofort. Wenn der Versuch fehlgeschlagen ist, verwenden Sie ein Elektrophorese-Netzteil, um einen negativen Schockreiz von 20 Millivolt auf ein Ampere anzuwenden, abwechselnd zwei Sekunden ein, zwei Sekunden aus für 15 Sekunden mit maximal vier Stößen oder bis der Fisch die Hälfte der Box passiert.
Beenden Sie dann sowohl den leichten als auch den negativen Reiz. Sorgen Sie vor der Einarbeitungszeit für eine erfolgreiche Akklimatisierung an die Shuttle Box, indem Sie den Fisch 15 Minuten lang unter dunklen Bedingungen stehen lassen. Dann leuchten Manuell eine 800 Lumen rote Linsen taschenlampe etwa zwei Zentimeter von der Gelboxwand auf der vom Fisch besetzten Seite.
Strahlen Sie den Lichtreiz direkt auf den Fisch und folgen Sie jeder seitlichen Bewegung des Fisches mit dem Licht, um eine kontinuierliche Visualisierung des Reizes zu gewährleisten. Während das Licht auf den Fisch scheint, gleichzeitig den nachteiligen Schockreiz von 20 Millivolt auf ein Ampere anwenden, abwechselnd zwei Sekunden ein, zwei Sekunden aus für 15 Sekunden mit maximal vier Stößen oder bis der Fisch die Hälfte der Box passiert. Sobald dies erreicht ist, beenden Sie den leichten und nachteiligen Reiz.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für 25 Iterationen. Nach Abschluss dem Fisch eine weitere Eingewöchnungszeit von 15 Minuten unter dunklen Bedingungen einrennen. Führen Sie während der ersten Testphase eine erfolgreiche Akklimatisierung in der Shuttle Box für 15 Minuten durch, tragen Sie dann bis zu 15 Sekunden lang nur den Lichtreiz auf und zeichnen Sie die Reaktionen auf.
Betrachten Sie den Versuch als erfolgreich, wenn der Fisch innerhalb von 15 Sekunden nach Dem Start des Lichtreizes die Hälfte der Shuttle-Box überquert und den Lichtreiz sofort stoppt, wenn der Fisch die Hälfte des Wegs überquert. Betrachten Sie den Versuch als fehlgeschlagen, wenn der Fisch 15 Sekunden nach dem Start des Lichtreizes nicht die Hälfte der Shuttle Box überquert und den Lichtreiz nach 15 Sekunden stoppt. Wenden Sie während des ersten Tests nach einem fehlgeschlagenen Versuch keinen negativen Stimulus an.
Führen Sie Kurzzeitgedächtnistests unmittelbar nach dem ersten Testzeitraum durch. Induzieren Sie dramatische Hirnverletzungen und warten Sie vier Stunden vor dem Testen. Dann akklimatisieren Sie den Fisch in der Shuttle Box für 15 Minuten.
Beurteilen Sie das Kurzzeitgedächtnis, indem Sie bis zu 15 Sekunden lang nur den Lichtreiz anwenden und aufzeichnen, ob der Fisch die Hälfte der Box überquert, bevor das Licht ausgeschaltet wird, als bestandener Versuch betrachtet wird oder den Halbzeitpunkt nicht innerhalb der 15 Sekunden überschreitet, die als fehlgeschlagener Versuch gelten. Wiederholen Sie den obigen Schritt 25 Mal mit einer 30-sekündigen Ruhezeit zwischen jeder Studie und notieren Sie die Anzahl der erfolgreichen und fehlgeschlagenen Studien. Führen Sie vier Tage nach dem ersten Test Langzeitgedächtnistests durch.
Induzieren Sie ein Schädel-Hirn-Trauma und warten Sie vier Stunden vor dem Test, dann akklimatisieren Sie den Fisch in der Shuttle Box für 15 Minuten. Beurteilen Sie das Langzeitgedächtnis, indem Sie bis zu 15 Sekunden lang nur den Lichtreiz anwenden und aufzeichnen, ob der Fisch die Hälfte der Box überquert, bevor das Licht ausgeschaltet wird, als bestandener Versuch betrachtet wird oder den Halbzeitpunkt nicht innerhalb der 15 Sekunden überschreitet, die als fehlgeschlagener Versuch gelten. Wiederholen Sie die oben genannten 25 Mal mit einer 30-sekündigen Ruhezeit zwischen jeder Studie und notieren Sie die Anzahl der erfolgreichen und fehlgeschlagenen Studien.
Der lehrreiche Überblick über die Lern- und Gedächtnisparadigmen für die kognitive Bewertung wird hier gezeigt. Der unbeschädigte Fisch mit acht Monaten, junger Erwachsener, 18 Monate, Erwachsener mittleren Alters und 24 Monate, älterer Erwachsener, erforderte eine ähnliche Anzahl von Versuchen, um das Verhalten der Vermeidung des roten Lichts zu lernen. Nach der Verwendung des Schweren Stumpfkraft-Trauma-Hirnverletzungsmodells (STBI) benötigten die Fische in verschiedenen Altersgruppen eine ähnliche Anzahl von Versuchen, um den Assay ein bis fünf Tage nach der Verletzung zu beherrschen.
Am ersten Tag nach STBI benötigten Fische jeden Alters eine ähnliche Anzahl von Versuchen, um das Verhalten zu erlernen, das signifikant größer war als die unbeschädigten Kontrollen. Der unbeschädigte Fisch meisterte die Shuttle Box schnell und erzielte fünf aufeinanderfolgende positive Versuche in etwa 17 Versuchen, während Fische eines Tages nach einer leichten Hirnverletzung oder einem leichten TBI eine signifikante Zunahme der Anzahl der Versuche zeigen, um das Verhalten zu lernen. Dieses Defizit erhöhte sich nach zwei leichten TBI und war nach drei leichten TBI-Verletzungen weiter erhöht.
Unbeschädigte Fische zeigen einen leichten Anstieg der prozentualen Differenz erfolgreicher Versuche im unmittelbaren Gedächtnis und im verzögerten Gedächtnis im Vergleich zum anfänglichen Testzeitraum. Nach einem einzigen milden TBI zeigten Fische im Vergleich zu unbeschädigten Fischen signifikante und sofortige Gedächtnisdefizite. Dieser Trend setzte sich mit wiederholten Verletzungen mit zunehmenden Defiziten nach zwei leichten TBI und drei leichten TBI fort.
Der Zeitpunkt der angewendeten unerwünschten Reize ist entscheidend. Die Paarung der negativen Reize mit dem Licht und ihrer gleichzeitigen Entfernung festigt ihre Assoziation und ist entscheidend für das Paradigma. Der Assay ermöglicht eine schnelle Beurteilung oder komplexes assoziatives Lernen, mit dem Entwicklungs-, Alterungs- und Umweltauswirkungen auf kognitive Beeinträchtigungen untersucht werden können.
