El ensayo Shuttle Box rastrea de manera reproducible la progresión y recuperación del deterioro cognitivo después de un trauma por fuerza contundente o cualquier otro tipo de lesión cerebral en el pez cebra. El ensayo Shuttle Box permite una medición relativamente simple, rápida y robusta del aprendizaje asociativo en la memoria a corto y largo plazo en el pez cebra. Para comenzar, prepare la Shuttle Box modificando una caja de gel de 30.5 por 19 por 7.5 centímetros con una pieza de plexiglás de grado acuario de 5 por 19 centímetros agregada a cada lado en un ángulo de 45 grados.
Luego haga una línea que marque el punto medio del tanque para evaluar cuándo los peces han cruzado el medio del tanque. Después de agregar 800 mililitros de agua del sistema a la caja del transbordador, coloque de dos a tres peces en un tanque de retención que contenga agua del sistema. Deje el tanque en la habitación oscura donde se realizará el ensayo de la caja del transbordador.
A continuación, en la habitación oscura, coloque un pez en el centro de la caja del transbordador. Asegure la tapa y conecte los electrodos a una fuente de alimentación. Los peces deben aclimatarse en la oscuridad.
Apague todas las luces y aclimate el pescado a la caja del transbordador durante 15 minutos. La aclimatación exitosa se puede considerar cuando el pez explora libremente el tanque. Después de la aclimatación exitosa de los peces, haga brillar manualmente una linterna de lente roja de 800 lúmenes aproximadamente a dos centímetros de la pared de la caja de gel en el lado ocupado por el pez.
No inicie una prueba si el pez está descansando junto al alambre de platino. Haga brillar el estímulo de luz directamente sobre el pez y siga manualmente cualquier movimiento lateral del pez con la luz para garantizar la visualización continua del estímulo. Continúe proporcionando el estímulo de luz hasta que se cumpla cualquiera de las siguientes condiciones para un ensayo exitoso o fallido.
Considere que la prueba es exitosa si el pez cruza el punto medio del tanque dentro de los 15 segundos posteriores a la exposición a la luz. Una vez que el pez cruce el punto medio, detenga el estímulo de la luz inmediatamente. Si el ensayo falló, use una fuente de alimentación de electroforesis para aplicar un estímulo de choque negativo de 20 milivoltios a un amperio, alternando dos segundos encendidos, dos segundos apagados durante 15 segundos con un máximo de cuatro descargas o hasta que el pez pase el punto medio de la caja.
Luego termina tanto la luz como el estímulo negativo. Antes del período de entrenamiento, asegúrese de una aclimatación exitosa a la Shuttle Box dejando a los peces en condiciones de oscuridad durante 15 minutos. Luego, haga brillar manualmente una linterna de lente roja de 800 lúmenes aproximadamente a dos centímetros de la pared de la caja de gel en el lado ocupado por el pez.
Haga brillar el estímulo de luz directamente sobre el pez y siga cualquier movimiento lateral del pez con la luz para garantizar la visualización continua del estímulo. Mientras la luz brilla sobre los peces, aplique simultáneamente el estímulo de choque adverso de 20 milivoltios a un amperio, alternando dos segundos encendidos, dos segundos apagados durante 15 segundos con un máximo de cuatro descargas o hasta que el pez pase el punto medio de la caja. Una vez logrado esto, termine la luz y el estímulo adverso.
Repita el proceso durante 25 iteraciones. Al finalizar, permita al pez otro período de aclimatación de 15 minutos en condiciones de oscuridad. Durante el período de prueba inicial, realice una aclimatación exitosa en la Shuttle Box durante 15 minutos, luego aplique solo el estímulo de luz durante un máximo de 15 segundos y registre las respuestas.
Considere que la prueba es exitosa si el pez cruza el punto medio de la Caja del Transbordador dentro de los 15 segundos posteriores al inicio del estímulo de luz y detenga el estímulo de luz inmediatamente cuando el pez cruce el punto medio. Considere el ensayo como fallido si el pez no cruza el punto medio de la Shuttle Box 15 segundos después de iniciar el estímulo de luz y detenga el estímulo de luz después de 15 segundos. Durante la prueba inicial, no aplique un estímulo adverso después de un intento fallido.
Realice pruebas de memoria a corto plazo inmediatamente después del período de prueba inicial. Induzca una lesión cerebral dramática y espere un período de cuatro horas antes de la prueba. Luego aclimatar los peces en la caja del transbordador durante 15 minutos.
Evalúe la memoria a corto plazo aplicando solo el estímulo de luz durante un máximo de 15 segundos y registre si el pez cruza el punto medio de la caja antes de que se apague la luz, se considera como prueba pasada, o no cruza el punto medio dentro de los 15 segundos considerados como prueba fallida. Repita el paso anterior 25 veces con un período de descanso de 30 segundos entre cada prueba y registre el número de pruebas exitosas y fallidas. Realice pruebas de memoria a largo plazo cuatro días después de la prueba inicial.
Induzca una lesión cerebral traumática y espere un período de cuatro horas antes de la prueba, luego aclimatar a los peces en la caja del transbordador durante 15 minutos. Evalúe la memoria a largo plazo aplicando solo el estímulo de luz durante un máximo de 15 segundos y registre si el pez cruza el punto medio de la caja antes de que se apague la luz, se considera como prueba pasada, o no cruza el punto medio dentro de los 15 segundos considerados como prueba fallida. Repita lo anterior 25 veces con un período de descanso de 30 segundos entre cada prueba y registre el número de pruebas exitosas y fallidas.
La visión general de la instrucción de los paradigmas de aprendizaje y memoria para la evaluación cognitiva se muestra aquí. Los peces no dañados a los ocho meses, adulto joven, 18 meses, adulto de mediana edad y adulto mayor de 24 meses, requirieron un número similar de ensayos para aprender el comportamiento de evitar la luz roja. Después de utilizar el modelo de lesión cerebral traumática por fuerza contundente severa, o STBI, los peces de diferentes edades requirieron un número similar de ensayos para dominar el ensayo durante uno a cinco días después de la lesión.
El primer día después del STBI, los peces de todas las edades requirieron un número similar de ensayos para aprender el comportamiento, que fue significativamente mayor que los controles no dañados. Los peces no dañados dominaron rápidamente la Shuttle Box, logrando cinco ensayos positivos consecutivos en aproximadamente 17 ensayos, mientras que un día después de una lesión cerebral leve, o una lesión cerebral traumática leve, los peces muestran un aumento significativo en el número de ensayos para aprender el comportamiento. Este déficit aumentó después de dos LCT leves y se elevó aún más después de tres lesiones leves de LCT.
Los peces no dañados exhiben un ligero aumento en la diferencia porcentual de ensayos exitosos en memoria inmediata y memoria retardada en relación con el período de prueba inicial. Después de una sola lesión cerebral traumática leve, los peces mostraron déficits de memoria significativos e inmediatos en comparación con los peces no dañados. Esta tendencia continuó con lesiones repetidas con déficits crecientes después de dos LCT leves y tres LCT leves.
El momento de la aplicación de estímulos adversos es crítico. Emparejar los estímulos adversos con la luz y su eliminación simultánea solidifica su asociación y es crucial para el paradigma. El ensayo permite una evaluación rápida o un aprendizaje asociativo complejo que se puede utilizar para investigar los impactos en el desarrollo, el envejecimiento y el medio ambiente en el deterioro cognitivo.
