このプロトコルは、ex vivo ERG、特にONバイポーラ細胞によって産生される非常に感度の高いB波で網膜機能を維持するために必要な条件を示しています。ex vivo ERGを使用すると、薬理学的物質の導入を容易にしながら、高い信号対雑音比でさまざまな種類の網膜ニューロンの機能を測定することができます。この方法は、網膜機能および疾患に対する薬理学的物質の有効性を定量化するのに特に適している。
まず、ex vivo ERG試料ホルダーをヘッドステージを介して差動アンプに接続して、多電極アレイのセットアップを変換します。アンプは、多電極アレイシステムのインターフェースボードのアナログ入力に接続する必要があります。多電極アレイ用の記録ソフトウェアを使用して、ex vivo ERGからの入力データを記録および保存します。
差動アンプのゲインを100に設定し、デジタイザの仕様に応じて10倍の電圧増幅を追加します。ローパスフィルターを100ヘルツに設定します。あるいは、パッチクランプのセットアップを変換するには、ex vivo ERG検体ホルダーをヘッドステージを介して差動アンプに接続し、差動アンプはパッチクランプアンプのヘッドステージに接続する必要があります。
パッチクランプシステムソフトウェアとデジタイザを使用して、ex vivo ERGからの入力データを記録および保存します。前に示したようにパラメータを設定します。適切な波長のLEDを顕微鏡に接続します。
光刺激を制御するには、デジタイザからのアナログ出力によって制御されるLEDドライバを使用します。光刺激のトリガーを可能にする記録ソフトウェアでLEDを制御します。次に、フォトダイオードを使用して、標本ホルダー内の網膜の位置でのLEDの光出力を校正します。
必要に応じて、減光フィルターを挿入して、光路の光の強度を暗くします。電極を準備するには、塩化銀ペレット電極をネジ付きルアーコネクタに挿入します。ルアーコネクターの内側をホットグルーで満たし、非ネジ側からホットグルーに2ミリのソケットを差し込みます。
EP-1電極の銀線を2ミリソケットにはんだ付けします。糸にOリングが付いた完成した電極をex vivoERG試料ホルダーの電極ポートにねじ込みます。人間のドナーの目を含む大きな目の場合は、残りの結合組織の地球をきれいにし、前部と水晶体を取り外します。
メスを使用して、リムバスから約3ミリメートルの切り込みを入れます。湾曲した解剖ハサミを切開部に挿入し、辺縁に沿って切断してレンズで目の前部を取り除きます。3〜6ミリメートルの使い捨て生検パンチでex vivo網膜電図用の網膜標本を入手します。
組織を検体ホルダーに取り付けるには、検体ホルダーの下半分を大きなペトリ皿に入れ、検体ホルダーのドームがちょうど水没するように酸素化エイムズ培地で満たします。細かい鉗子で網膜の端を注意深くつかみ、網膜をex vivo標本ホルダーのドームに移し、感光体側を上に向けています。標本ホルダーをエイムズの溶液から持ち上げ、網膜が所定の位置に留まるように注意します。
試料ホルダーのプレートを完全に乾燥させて、ノイズ、電気的クロストーク、信号シャントを最小限に抑えます。次に、試料ホルダーの両半分を4本のネジで組み立て、灌流ラインを接続します。試料ホルダーの下半分の電極を打ち込み、アノードケーブルを網膜内側に、カソードケーブルを感光体側に接続します。
検体ホルダーに少なくとも1ミリリットルの酸素化エイムズ培地を10〜20分間灌流して、光応答を安定させます。Ex vivo ERGは、マウス網膜からの光受容体およびONバイポーラ細胞光応答の記録を可能にしました。ヒトドナー網膜からの光受容体応答の記録は、核摘出の死後最大5時間の遅延と、ONバイポーラ細胞応答の20分未満の遅延で可能でした。
理想的な条件下では、両方の細胞タイプの応答振幅と動態は時間の経過とともに比較的安定していましたが、網膜が標本ホルダーに取り付けられてから40〜45分後にゆっくりと減少しました。試料ホルダー内の温度の低下は、光受容体とONバイポーラ細胞の両方の動態を大幅に遅くしました。ただし、B波の振幅は減少しましたが、A波の振幅は減少しませんでした。
逆に、灌流速度を遅くすると、光受容体とONバイポーラ細胞の両方の応答の振幅が減少しましたが、A波またはB波の暗黙の時間には影響しませんでした。灌流を10分間停止した後、再灌流すると、光受容体応答が保存されたONバイポーラ細胞機能が完全に失われました。十分な灌流速度と生理学的温度は、特にex vivo ERGのONバイポーラ細胞から安定した応答を得るために重要です。
このプロトコルにより、ヒト黄斑と末梢における視受容体機能の違いを詳細に調査することができ、以前はヒト以外の霊長類でしか実行できなかった質問に答えることができます。
