The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

このプロトコルは、「ビジョンと眼科での研究のための協会の実験動物の管理と使用に関する指針」の推奨事項に従って行われます。 1.卵取り扱いとアイコレクション<ol><li> 1週間以上、もはや用に12〜14℃の白色レグホン卵を保管してください。可能な場合は、受精卵を保存する冷蔵ワインクーラーを使用しています。 注意：より低い温度では死亡率を増加させながら、高い店の温度は、胚の異常な開発につながります。拡張ストレージ時間が死亡し、異常な開発の両方を向上させます。 </li><li>穏やかに24時間あたり5回の頻度でロッキングと37.5°Cで卵と60％の加湿卵インキュベーターをインキュベートします。 </li><li>希望胚年齢で卵のインキュベーターから培養した卵を削除します。 注：ニワトリ胚の年齢は、インキュベーションの時間として決定され、胚日（E）として、または段階として示される（ST）、ハンバーガーとハミルトン12で説明した発達段階の一連に従って。 </li><li>層流フード内で選択された卵を置きます。胚の汚染を避けるために70％エタノールで卵殻を拭きます。 注：滅菌溶液を無菌条件下ですべての手順を実施<url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url>そして、楽器。 </li><li>卵を開いてクラックするのは難しい表面に対してしっかりと卵の側をタップします。 100ミリメートルペトリ皿内のコンテンツを配置します。乾燥から組織を防止するために、予め温めた（37℃）1×PBSを含む35 mmのペトリ皿に胚を転送する小スプーンを使用します。 </li><li>層流フード内で両眼立体視の解剖顕微鏡上に胚組織を含む35ミリメートルペトリ皿を置きます。細かい鉗子で首をつまんで胚を刎ねると体を捨てます。 </li><li>切開目を作るために細かい鉗子を使用して、ラフ、口、目に腹。切開部位から開始し、全体の眼の周囲の組織を開いて涙。視神経をピンチオフし、目のソケットからそのまま目を削除します。制御または処置した眼のいずれかとして使用するために同じ胚からの左と右眼の両方を収集します。 </li><li>予め温めた（37℃）1×PBSを含む新しい35ミリメートルペトリ皿に目を転送するために、小さなスプーンを使用してください。 </li></ol>全網膜外植片の作製<ol><li>強膜原基を含む眼の周りのすべての組織を除去するために微細な鉗子を使用してください。 注：組織は、色素上皮そのまま（ 図1A-B）と硝子体とレンズで網膜を残して簡単に取り外します。 </li><li>神経網膜（ 図1C）を損傷することなく、眼の背側部分の色素上皮に小さな切開を挟ま細かい鉗子を使用してください。 </li><li>優しく色素上皮startiを開き引き裂く細かい鉗子を使用して、レンズと硝子体（ 図1D）に接続されている網膜全体を残して、切開部位でngの。色素上皮の除去を容易にするために、温かい（37℃）1×PBS中で目を離さありません。 注：色素上皮は、眼の前方領域であり、脈絡膜の亀裂に沿って、瞳孔の周りの毛様体に沿って具体的には、除去するのが困難な場合があります。したがって、色素上皮の一部が神経網膜（ 図1E-F）上に残してもよいです。 </li></ol>全網膜外植片の3治療<ol start="1"><li>全体の網膜の外植片のエレクトロポレーション 注：全体の網膜外植片のエレクトロポレーションはステップ2の後に直接実行することができます。 <ol><li> 1 DMEM：F12の栄養ミックス、10％のFBS、10 U / mlペニシリンストレプトマイシン、5μg/ mlのインスリン、および2mM L-グルタミン1を含む培地を準備します。 </li><li> 1.5ミリリットル使い捨てプラスチックキュベットをカット（12.5ミリメートル×12.5ミリメートルのx 45メートルM）（または微ブレードソーを用いて底部から）約8mmの300-400μlの溶液を保持することが可能な任意の小容器。 </li><li> 0.1μgの/μlの最終濃度に1xDPBSにおける選択肢のDNAプラスミドを希釈します。 </li><li> ST20のために15 Vにエレクトロと設定パラメータをオンにします - ST25（E3-E4）網膜とST26のための20のV - ST27（E5）網膜。 1秒間隔で50ミリ秒パルス長の5パルスにパルス繰り返しを設定します。両手が所定の位置に電極を保持するために必要とされるように床に足ペダルで制御することができるパルス発生器を使用してください。 </li><li>形の2パドル（フラット、円形DIAM 4 mm）の白金電極（ 図2A）は 、パルス発生器の出力ソケットに接続します。 注：このプロトコルで使用される白金電極は、大学のワークショップによって作られました。電極は、0.1ミリメートルの白金板」rondelles」（：950のPt / 5銅プラチナグレード）から作られました。接続0.8ミリメートルののwi再プラスチックチューブを用いて絶縁しました。 </li><li>慎重に網膜の外植片のための右先端開口サイズを取得するためにカットオフ先端を有するポリエチレンパスツールピペットを用いて、キュベット（または同等の小型容器）へのステップ2.3からの全網膜外植片を移します。網膜は、プラスチックに付着し、引き裂くする傾向があるとして、ピペットチップを使用しないでください。 </li><li>優しく引き裂きを回避するために、網膜に触れないように注意して網膜の外植片を取り巻く全体の1×PBSを除去するために、100μlのピペットを使用してください。 </li><li>全体の網膜の外植片をカバーするためにキュベットに100μlのプラスミド溶液を追加します。それがトップに浮上する場合は慎重にピンセットで網膜の外植片を押し下げます。キュベットの底にキュベットおよび視神経のいずれかの側を向くようにレンズを配置する鉗子又は電極を使用してください。 </li><li>組織に触れることなく、レンズと網膜（ 図2A）の背後にある負極の前で正極を配置します。 </li><li>フットペダルを押し下げて電流を適用します。成功した放電を示す電極での泡のために確認してください。 </li><li>網膜を損傷することなく、キュベットからすべてのプラスミドミックスを除去するために、100μlのピペットを使用してください。プラスミド混合物は、3〜5回再利用することができます。 </li><li>予め温めた（37℃）1×PBSでキュベットを埋めます。優しくキュベットの壁から網膜外植片を分離するために鉗子を使用してください。エレクトロポレーション後、網膜は、時にはそれがキュベットの壁に付着させる泡で覆われています。 </li><li>ウェルあたり1ミリリットル予め温め（37℃）培地を含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するためにポリエチレンパスツールピペットを使用してください。ウェルあたり1網膜外植片をインキュベートします。 </li><li> 24時間、5％CO 2で細胞インキュベーターの内部で、毎分50回転の一定速度で、回転子シェーカー上で37℃での網膜外植をインキュベートします。回転を培地にし、preveに最大の露出を確保することです24ウェルプレートの底に網膜のNT接着。 </li><li>ステップ4に進みます。 </li></ol></li><li>化学試薬を用いた全網膜外植片の治療 注意：全体の網膜の外植片の化学的処理は、ステップ2の後に直接実行することができます。 <ol><li> 1 DMEM：F12の栄養ミックス、10％のFBS、10 U / mlペニシリンストレプトマイシン、5μg/ mlのインスリン、および2mM L-グルタミン1を含む培地を準備します。 </li><li> 1ミリリットルにウェル当たり予め温め（37℃）培地を含む24ウェルプレートにステップ2.3から網膜外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。ウェルあたり1網膜外植片をインキュベートします。 </li><li>化学試薬またはビヒクルを添加する前に5％CO 2での細胞培養器の内部で、50 rpmの一定速度で、回転子シェーカー上で37℃で60分間、全網膜外植片をインキュベートします。 </li><li>例えば、薬液を調製するCdk1 / 2阻害剤III、最終的にM期の進行13の阻害剤DMSO中、30μMの濃度。 </li><li>細胞インキュベーターから、全体の網膜の外植片を含む、24ウェルプレートを取り外します。 0.01％DMSO中300 nMのCdk1の/ 2阻害剤IIIの最終濃度で、その結果、網膜の中に直接化学試薬またはビヒクル（DMSO）の10μLを追加します。手動で、溶液中の化学試薬または車両の均一な分布を可能にするために、24ウェルプレートを回転させます。 </li><li>希望の時間（最大24時間）、5％CO 2のインキュベーターの内側に、毎分50回転の一定速度で、回転子シェーカー上で37℃での網膜外植片をインキュベートします。 </li><li>ステップ4に進みます。 </li></ol></li></ol> 4.固定全体網膜Eexplantsの凍結<ol><li>細胞インキュベーターから治療全体の網膜外植片を含む24ウェルプレートを取り外します。 </li><li> 1×PBSで1ミリリットル/ウェルの氷冷4％パラホルムアルデヒドを含む24ウェルプレートに網膜外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。 Incuba15分間氷上でTE。 </li><li>網膜を洗浄するために1ミリリットル/ウェルの氷冷を1×PBSを含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。氷上で10分間インキュベートします。 </li><li> 1ミリリットル/を1×PBSでよく氷冷30％スクロースを含む24ウェルプレートに全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。網膜の日胚に応じて1〜3時間、氷上でインキュベートします。 ST20について - ST25（E3）網膜は、1時間インキュベート、古い網膜は、スクロースより長いインキュベーション時間を必要としています。 </li><li>約500μlのクライオスタット凍結マウンティング培地を含むパラフィンフィルム上に全体の網膜の外植片を転送するために、小さなスプーンを使用してください。そっと小さなスプーンを使用して、凍結培地の網膜外植片を移動させることにより、できるだけ多くのショ糖、できるだけ削除します。 </li><li>凍結培地を含む埋め込む型に網膜外植を転送します。将来の切片を容易にするために、目の位置を調整します。 DRの全網膜外植片を含む埋め込む型を入れて中までのy氷は固体凍結されます。 -80℃で保存してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

この作品では、切開、エレクトロポレーションまたは化学的処理、およびニワトリ胚からの全体の網膜の外植片を培養するための詳細なプロトコルが提示されています。このプロトコルは、迅速、簡単であり、高い成功率と再現性の両方を可能にします 結果。 全網膜外植片のエレクトロポレーションは、対象の遺伝子構築物を発現する細胞の大部分を生成?...

網膜は中枢神経系の一部であり、その相対的な簡単さと十分に特徴付け細胞構造、中枢神経系の発達を研究するための人気のあるモデルです。ニワトリ胚の眼は、胚の残りの部分に比べて相対的に大きいです。従って、このような注射またはエレクトロポレーションなどの実験操作のための卵内に容易にアクセスでき、網膜細胞や生体内で発生生物学に関する知識を得るための優れたツールとして機能します。実験は、エレクトロポレーション、反復注射、または組み合わせた実験操作と同様に侵襲的であるとき、これらの主要な利点にもかかわらず、胚の生存率は低くすることができます。 卵内ニワトリ胚へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは重要であり、十分に確立された技術1です。これは、神経細胞の標識化を可能にする細胞の運命の追跡だけでなく、中央NERVにおける神経管OUのシステムは、それがインビボでタンパク質機能を解析するための異所性の遺伝子発現を可能にします。技術は、3後脳、および4網膜、神経管2の研究のために使用されてきました。 卵内胚網膜のエレクトロポレーションは、in vivoでの状況に関連したいくつかの実験の困難を持っています。胚の頭蓋折りたたみに起因する目の位置は、心臓に比較的近いです。この接近は、エレクトロポレーション後の心停止のリスク、および胚の年齢とともにリスク増加が増加します。また、目にアクセスするために、それによって出血、奇形およびその後の生存率減少のリスクを増加させる、胚の膜を開くことが必要です。既知の表現型の結果なしで、多くの場合、新たなDNAプラスミドをテストし、最適化する場合、これらの制限はあっても、経験豊富な実験者のための方法の有効性とパワーを減少させることができます。このプロトコルは、Wの文化の中で提示したよう削除色素上皮と神経網膜全体として形成された孔網膜外植は、OVOのアプローチで補完する効率的な方法です。 化学試薬の眼内注射は 、OVO で実行するのが比較的容易です。しかし、神経網膜内注射、試薬の有効かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。注入量は、漏れに変えることができ、注射の正確な部位は、眼内の試薬の分布と硝子体を通して拡散の両方に影響を与える可能性があります。酵素阻害剤のための、すなわち、用量応答曲線を決定する際の変動は、結果の解釈のために主要な影響を有することになります。特に効果が小さく、効果の時間窓が狭い場合。血流を介し潜在的な全身作用のために、OVOの実験で行うときにまた、唯一の目には、各胚から使用することができます反対側の眼へ。開発および処置および対照胚は、追加実験の変動につながる可能性の間の個体差を検討する際に年齢のマッチングが重要です。 これらの理由のために、ニワトリ胚の網膜外植片に基づく方法卵EXは、神経網膜を均一に露出し、 インビトロで実験条件を制御することが可能で、開発されました。現在のプロトコルは、以前のプロトコル5-9に基づいて開発されました。ステージからの網膜外植体（ST）、ST31〜20（3胚日[E]）は、（E7）は、ニワトリ胚を培養し、解剖し、エレクトロポレーション定義DNAプラスミドの濃度または化学試薬の規定された濃度を含有する培地に曝露しました。ここで紹介するプロトコルは成功し、このようなKU55933、SB 218078、およびNSC 109555 DITOなどのDNA損傷経路の調節因子を含む、いくつかの異なる化学試薬を使用して、最近の出版物に実装されましたこのようするCdk1 / 2阻害剤III 10,11としてsylate、および細胞周期、。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Local supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

網膜は、発展途上の中枢神経系のための優れたモデルです。 OVO / in vivoでの実験操作のための目のサイズが大きいと、最も重要なアクセシビリティ鶏胚網膜汎用性と非常に効率的な実験モデルを作成します。鶏の網膜は眼内注射またはエレクトロポレーションによって卵内標的にするのは簡単ですが、網膜内の試薬 ​​の効果的かつ正確な濃度は、完全に制御することが困難な場合があります。これは、眼または物質の不均一な拡散の正確な注射部位、漏れの変動に起因し得ます。さらに、このようなエレクトロポレーションなどの侵襲的な操作後の奇形や死亡の頻度はかなり高いです。 このプロトコルは、ニワトリ胚から全網膜の外植片を培養する技術OVO EXを記述し、試薬に網膜の制御された露光のための方法を提供します。プロトcolが実験的に、解剖操作、ニワトリ胚の培養全体の網膜の外植する方法について説明します。外植片は、約24時間培養することができ、例えば、エレクトロポレーションのような別の操作に付すこと。主な利点は、実験は、胚の生存に導入試薬の濃度を変化させると効果的な濃度を決定し、最適化するために制御することができる依存しないことです。さらに、この技術は、その高い実験成功率とともに、迅速、安価であり、それは再現性を保証します 結果。それは卵内行われた実験に優れた補完するものとして機能していることを強調すべきです。

このプロトコルは、ニワトリ胚からの全体の網膜の外植片の準備（ 図1A-F）および培養について説明します。このプロトコルが正常にST31にST20（E3）の胚からの全体の網膜外植（E7）のために使用されています。 全網膜外植片へのDNAプラスミドのエレクトロポレーションは、網膜前駆細胞の標識および追跡のためにまたは過剰発現の異なる遺伝子産物のことが?...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

このプロトコルは、解剖実験的に操作し、ニワトリ胚の培養全体の網膜外植する方法について説明します。高い成功率、有効性と再現性をエレクトロポレーションおよび/ ​​または試薬物質、 すなわち、酵素阻害剤のためのプラスミドの効果をテストするために必要な場合、外植片培養は便利です。

エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K ビュー.  Uppsala University. このプロトコルは、解剖実験的に操作し、ニワトリ胚の培養全体の網膜外植する方法について説明します。高い成功率、有効性と再現性をエレクトロポレーションおよび/ ​​または試薬物質、 すなわち、酵素阻害剤のためのプラスミドの効果をテストするために必要な場合、外植片培養は便利です。 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

発生生物学

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

多光子顕微鏡によるライブセルイメージングのための大人のトランスジェニックゼブラフィッシュ網膜外植片の文化

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

マウス骨格筋移植からの原発性筋芽生の単離と分化

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...