この作品は、NIHのグラントDP2OD008470によってサポートされていました。

このプロトコールに記載ゼブラフィッシュの胚を操作するための手順は、ノートルダム大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 1.リンゲル溶液の調製<ol><li>任意の塩の析出を回避するために、継続的な攪拌を介して超純H 2 Oで116のNaCl、2.9のKCl、3.6 mMのCaCl 2を 、および5mMのHepesの溶液を作ります。 </li><li>塩を添加し、溶液が依然として撹拌している間した後、100単位/ mLのあたりペニシリンおよび1mlあたり100μgのストレプトマイシンを追加します。 </li><li>すべての抗生物質との塩を添加した後、滅菌容器内の溶液と店舗のろ過滅菌を行います。 注：N-フェニルチオ尿素（1-フェニル-2-チオ尿素）またはPTUは、胚の健康への悪影響なしにビーズ移植胚における色素の形成を阻止するためにリンゲル液に添加することができます。リンガー/色素ブロッキング溶液を調製し、concenを使用0.003％PTUのtration。原因追加するPTUの低濃度にはPTU粉末の微小量を加えることを避けるために、少なくとも1 L、リンゲル液の大容量がなされることをお勧めします。溶液は攪拌されながら、ステップ1.2の間にPTUを追加します。 </li></ol> 2.トリカイン溶液の調製<ol><li> 9.5のpHにバランスのとれた、超純H 2 Oで作られた1 Mストックから、溶液1L当たり3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（トリカイン）の2グラムを加えた0.1Mトリスを追加 注：トリカインビーズ注入表現型をアッセイするために、所望の時点でのゼブラフィッシュ胚を安楽死させるために使用されます。 </li></ol> 3. E3溶液の調製<ol><li> E3の1 Lを作成するために、0.25MのNaCl、10mMの塩化カリウム、12.5ミリモルのCaCl 2、および16.6 mMの硫酸マグネシウムの超純水L 1の溶液を作ります。 </li><li>真菌の増殖を阻害するためにE3溶液にメチレンブルーの200μlを添加します。 </li></ol>マイクロビーズの転送のために針を引っ張る4 <ol><li> 1.0ミリメートル、ID：0.5ミリメートル、長さ10cmでのODでフィラメントと火災研磨ホウケイ酸ガラスを使用してください。 </li><li>細い針を準備するためにマイクロピペットプラーにborosilicatedガラスを置きます。 注：= 245、速度= 200、および時間= 125を引き出し、ヒート= 540：次の4つの寸法は、針を引っ張るための出発点として使用することができます。 </li><li>使用するまで、針の先端を壊す防止するために、粘土や粘着テープのストリップに位置し、針の適切な数、カバーされたプラスチック製のペトリ皿中の店を、引っ張りました。 </li><li>希望ボアサイズに針の先端をトリミングするには、針の端部を獲得するために微細な鉗子のペアを使用しています。 注意：針の穴の大きさは、利用されているマイクロビーズの大きさだけでなく、ユーザーの取り扱いの好みに応じて異なります。 50〜100μmでの範囲のマイクロビーズを利用する場合は良い出発点は、100〜200μmの範囲でクラフトボアサイズにあります。 </li><li>プリオ完成したマイクロビーズの転送装置を形作るために毛細管ホルダーにトリミングされた針を挿入し、使用するには、r。 </li></ol> 5.ウィスカ/ラッシュツールの準備<ol><li>ウィスカー、ラッシュ、または天然または人工毛フィラメントの他の小さなまだしっかり作品を入手します。 45°の角度で、フィラメントのベースの近くにカットします。恒久的に透明な接着剤の接着剤を使用して、P-1000マイクロピペットの先端にウィスカを接着。 </li></ol> 6.マイクロビーズ移植トレイの準備<ol><li> E3溶液100mlを2％E3アガロースゲルを作るためにアガロースを2gを混ぜます。 </li><li>以上バブリングからゲルを回避するために、フラスコを30秒ごとに旋回250mlの三角フラスコに1分30秒間、2％アガロース溶液を加熱します。 </li><li> 60ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿の蓋を取り、上向きに内部と大きく150ミリメートル×15 mmディッシュに入れてください。 </li><li>ダウンアンカーに確認しながら、150ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿に熱いアガロースゲルを注ぎます人差し指で小さい皿の蓋。 注：アガロースゲルを注ぐときに形成することになる結露を除去するために小さい皿の蓋以下の薄層を許可します。これは、解剖顕微鏡下で見てビーズが容易になります。 </li><li>アガロースが冷却されると、それが固化する前に、ゲルのウェル金型を配置します。これは、胚の容易な配置を可能にします。 </li><li>注：それはゲルの上に浮遊するまで、ウェル内の気泡を回避するために、角度でゆっくりと金型を配置します。 </li><li>ゲルが固化した後にミクロを使用して、慎重に井戸型を削除します。 4℃でE3のソリューションとストアを追加します。 </li></ol> 7.胚コレクション<ol><li>システム水でそれらを充填し、その後チャンバーO / Nで大人のゼブラフィッシュの雄（複数可）とメス（S）のペアを配置することにより、分周器によって分離された嵌合室を準備します。 </li><li>細かい金網ストレーナーを使用して受精卵を収集し（胚のステージは若干異なります）。 </li><li>そこに皿の中のE3溶液約25ミリリットルをストレーナーに残された卵がなくなるまで逆さまにストレーナを回すとE3の細い流れでそれをすすぐことによって、クリーン、直径10cmシャーレに受精卵を堆積し、。 </li><li>収集後、クラッチ内の発達非同期につながり、困難な所望の時間点を収集するかもしれない過密を回避するために、いくつかの皿（皿当たり約50〜60の卵）に卵を割ります。 </li><li>標準的なゼブラフィッシュステージングシリーズ40に従って発達評価を可能にするために28.5℃のE3溶液中で胚をインキュベートします。 注：胚は、古い段階での操作は、光学的透明度を必要とする場合は、顔料の開発を防ぐために、24時間後に受精（HPF）でE3 / PTUに転送する必要があります。 </li></ol> 8.ビーズ移植<ol><li>所望の試験分子濃度のマイクロビーズまたは対応する車両のインキュベート適切な量​​で必要な時間のためのolution。 注：研究者は、溶液内のマイクロビーズの可視化を可能にするどちらの無菌直径3〜6センチメートル範囲のペトリ皿、またはマルチウェルプレートを使用することができます。時間は、目的の分子の種類や量に応じて変えることができる、と研究者は、インキュベーションの持続時間と、光や温度に対する感度などの他の側面については、メーカーまたは公開勧告を参照してください。 </li><li>胚は、所望の発達の時点に到達した後、微細な鉗子を使用して、絨毛膜から胚を削除します。 </li><li>溶液に、それらを順応さ10分間の抗生物質でろ過リンゲル液中の胚を培養します。 </li><li>胚が順応している間、注入トレイに囲まビーズプレートにビーズを移し、10分間、リンゲル液でそれらを洗浄。 注：この時点に到達した後、50分以内にビーズを埋め込みます。このW病気の一つは目的の分子の小さい濃度のビーズを注入する可能性を減少させます。 </li><li>マイクロビーズが移植される関心領域がアクセス可能であるように、それらの向きに注意しながらマイクロビーズ注入トレイのウェルに配列胚を、。 </li><li>タングステン針を使用して胚に小さな切開を行います。 </li><li>静かにキャピラリカラムにマイクロビーズを引っ張る、ピペットの電球を押下し、目的の宛先にマイクロビーズを転送するために圧力を解放する：マイクロキャピラリートランスファーピペットを用いて、胚にマイクロビーズを転送します。 </li><li>胚の内部にマイクロビーズを配置するためにウィスカー/ラッシュツールを使用します。注：それが治癒するようにマイクロビーズは、胚から追放されることはありませんので、切開部位から離れた組織へのマイクロビーズを配置するようにしてください。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

過去一世紀にわたり、ボディープランのパターニングおよび器官形成の理解は記念碑的な進歩を遂げています。組織操作技術は、これらの重要なプロセスに関する重要な情報を暴くで批判しました。遺伝子改変は、遺伝子機能を確認するための最も一般的に使用される方法の一つであり、そのような細胞移植などのモザイク分析方法は、遺伝子機能の自律性を理解するための有用なアプローチを提供します。マイクロビーズの注入は、この方法は、シグナル伝達分子または阻害剤を導入することにより、局所的な組織の環境を変更するために研究者を可能にするように、発達のダイナミクスを変更する方法を特定の分子尋問するために別の会場を提供しています。異なるマイクロビーズの範囲は、様々なサイズ及び他の物理的特性は、それらが目的の実験条件のために使用することができるように（ 例えば、電荷）が存在したので、市販されています。したがって、タンパク質またはケミに浸漬されたマイクロビーズを注入することにより生体内の関心の的、研究者が開発中に局所的な影響を調査し、関心と特定の生物学的表現型（複数可）の遺伝子または分子との間の関連を見つけることができます。 このようなゼブラフィッシュ23で前方脳頭蓋（ANC）における骨格パターニングにおける増加したヘッジホッグシグナル伝達の効果を評価するために、マイクロビーズの注入を使用和田らによって行われたものと研究。以前の研究でのShhは、ANC形成14に必要とされることを示しています。 Shhのコーティングされたマイクロビーズの研究を使用して、この信号はANCに軟骨形成を促進することを確認しました。マイクロビーズの注入工程はANCにおけるヘッジホッグシグナリングおよび軟骨形成の間に明確な関連性を実証するために使用されました。ゼブラフィッシュでは、この組織の操作技術のもう一つの重要な例は、科学者がErythroblastoma二十六（ETS）ドメインfの転写制御を調査した研究で観察されます初期のゼブラフィッシュの脳の発達19中のFGFシグナリングによる俳優ETS関連分子（ERM）およびポリオーマエンハンサー活性化因子3（PEA3）。マイクロビーズの移植実験を通じ、彼らはFGF8とFGF3は異所的にERMとPEA3の発現を活性化することができることを示すことができました。これらの例は、遺伝子発現を評価するための41の方法を使用することによって十分に特徴付けられる組織形成の発達の間に協力機構への洞察を提供するために、マイクロビーズの有用性を示しています。このように、マイクロビーズの移植は、腎臓を生じる中間中胚葉（IM）などの他の組織を、探検する実行可能な方法であることができます。具体的には、ネフロンにどのような影響を与えるか異なる分子を調査するために、腎臓の発達研究に役立つだろう、表面的にしか存在で理解されているプロセスを42と細管形成43,44セグメンテーション 。また、マイクロビーズの注入をスタッドに使用され始めていますY再生ゼブラフィッシュ29の処理]このようなネフロン45のような、または対応する成体構造に研究を実行するために策定されている方法と組み合わせて胚組織のレーザアブレーションを以下のように、臓器再生モデルの任意の数で使用するために適合させることができます46-49。最後に、マイクロビーズの注入は、癌50,51または組織変性52,53などのヒト疾患のモデルで使用される可能性を有します。 本プロトコルでは、我々はまた、同様に他の研究者によって記載されますが、ビデオプロトコル1を介して図示していないされたゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズ移植の方法を示しています。最小限の練習で、私たちは、研究者はいくつかの経験を持っていたら、この手順の実行可能性に関する8-10胚/時のおおよその速度でマイクロビーズを注入することができました。本明細書に示された結果は、様々なDのビーズを実証しますimensionsは初期段階で注入することができ、注意していることを、この組織操作技術は、胚への最小限の物理的破壊を用いて実施することができます。強調されるべきである1つの改良は、胚にマイクロビーズを配置するウィスカー/ラッシュツールの使用です。機器のこの比較的安価でシンプルな作品は、マイクロビーズと同じ直径程度で入手が容易で、注入プロセスをスピードアップするのに役立ちます。ウィスカー/ラッシュは、研究者の器用さや好みに応じて、まだ繊細なビーズハンドリングツール会社を生成するために所望の長さに切断することができます。我々は物理的に注入を行うマイクロビーズとゼブラフィッシュの胚を操作する方法をここで説明しながら最後に、このプロトコルは、異なる薬剤またはペプチドに特異的処理手順の概要を説明していません。一般に、化学的に処理されたマイクロビーズは、生物の他の領域における望ましくない効果を回避するために、便宜に動物に移植されるべきであり、研究者は、ウェル中にあるべきです彼らの研究を開始する前に、そのような化学物質に関連する可能安全性の懸念の周りに形成されました。 合計では、実験室で容易に入手可能な材料を使用してアプリケーションの広い範囲で比較的簡単かつ効率的なマイクロビーズの注入方法を実証しました。最終的には、このマニュアルでは、ゼブラフィッシュ組織操作の繊細な自然と研究者を支援することを願っています。

発生生物学の研究者は、生物がどのように形成されるか制御するメカニズムを解明するために、細胞の分子、および遺伝学的方法の広大な配列を利用します。これらのアプローチの中で、組織操作は、細胞の運命、セルラー移動、および組織の組織に関する複雑な問題の解読において重要なツールです。局所組織環境を変化させる一つの方法は、タンパク質または他のシグナル伝達分子1の焦点源を送達するために使用されるマイクロビーズの外科的適用によるものです。実験操作のこのタイプは、広くそのようなカエルとひよこ2のように、古典的な脊椎動物の発生学モデルに実装されています。 ゼブラフィッシュは、器官形成の研究のための重要な脊椎動物のモデル生物となり、また、彼らは人間6で高い遺伝的保存を共有するような疾患モデル3-5のために多くのユニークな利点を提供しています。特に、光学的透明性およびexゼブラフィッシュ胚のternal開発は、組織個体発生3-5の観察のための比類のない視点を提供しています。大規模フォワード遺伝子スクリーニングの実施は、さらなる研究7,8、および効率的に単一の研究室9,10に縮尺で行うことができる代替のスクリーニング技術を識別するためのゼブラフィッシュ変異株の強力なリポジトリを生成しました。ゼブラフィッシュを用いたさらなる実験作業は、トランスジェニックの方法論の進歩によって容易と遺伝的アプローチ11,12、並びに化学遺伝学13-15を逆転されています。 このようなマイクロビーズの実装などの組織操作技術は、広くはゼブラフィッシュで用い、それにもかかわらず、さらに開発中に細胞のシグナル伝達を理解するための有用なツールを提供していません。マイクロビーズの注入は、ゼブラフィッシュ網膜における器官形成の過程を調べるために使用されています16,17、心臓18、脳19-22、神経堤23、およびフィン24,25。これらおよび他の研究では、ビーズは、勾配は、細胞遊走27と軸28のパターニングにどのように影響するかのシグナル伝達分子26の拡散を理解するために開発中に適用されてきました。より最近では、マイクロビーズは、ゼブラフィッシュ、成人29に再生機構を評価するために利用されています。発達研究では、例えば、ゼブラフィッシュマイクロビーズワークは胸びれ25の研究を通じて肢形成のメカニズムへの洞察を提供してきました。ゼブラフィッシュの胸びれの芽は、マウス30とひよこ31で前肢芽に相同です。 ソニックヘッジホッグ（Shhの）の発現および下流のHox遺伝子標的を介して前方対後方軸を確立する偏光活性（ZPA）のゾーン、：脊椎動物の肢芽は、2つの重要なシグナル伝達ノードを持っていますおよび線維芽細胞増殖因子（FGF）の発現を介して四肢の先端アイデンティティの近位を確立するように作用する肢芽の先端に存在する外胚葉性頂堤（AER）。ゼブラフィッシュShhの遺伝的変異体の中にのFgf浸したマイクロビーズを注入することにより、研究者ら脊椎動物の肢25の細胞周期および成長の進行に必須であるとのFgfが同定されました。に加えて 位置アイデンティティを確立FGF およびShhのシグナル伝達カスケード、アイデンティティ32を後方より前方を確立するために、偏光領域の作用を模倣することができる分子としてレチノイン酸（RA）が同定ニワトリ肢芽を使用して先駆的な研究。ニワトリ肢にRA-浸したワットマン濾紙の小片を置く関与これらの実験は、桁のパターニング32を評価しました。さらに、研究者はマイクロビーズの使用を採用し、他のエレガントな研究を行っている、細胞移植、および外因性ゼブラフィッシュにおけるRAの治療は、RAは、ゼブラフィッシュ後脳および中胚葉28内に長距離の位置の手がかりを提供するために作用することを決定しました。しかし、現在では多くの疑問が脊椎動物の発生の多くの側面の間にFGFおよびRAのような要因をシグナリングの役割について残ります。 RAのシグナリング効果は、モルフォゲンとして作用し、そのようなRAは、近位腎細胞が運命35-39を入力指定開発心臓34および腎前駆細胞、など多くの臓器33を 、影響を与えます。そのような話題のさらなる理解は、組織操作およびマイクロビーズ注入技術を用いた実験的研究から大きく利益を得ることができます。 少数の研究は、ゼブラフィッシュでマイクロビーズを注入して行われてきたが、ニワトリなどのモデルと比較すると、実施されたものは非常に有益でした。ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植ベース - 研究の不足の1つの理由はlikelですY障害が正常にそのような操作を実行するために構成する胚の大きさに基づいて、困難な技術的課題が存在するという考え。しかし、ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの注入が実際に学び、技術の目視で支援し、したがって開発のメカニズムを調べるための手段として追求することができますすることができます。ここでは、組織形成および細胞形態形成に多種多様なアッセイを行うために利用することができるゼブラフィッシュ胚にマイクロビーズの正確な適用を実証します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FB-500-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2707402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly Sulfoxide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45-106 &#181;m)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140-1454 AG1-X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45 &#181;m)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>7314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube holder</td>
			<td>Globe Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>51674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

ゼブラフィッシュは、発生生物学と疾患の研究のための貴重な遺伝モデル系として浮上しています。ゼブラフィッシュは、ヒトを含む他の脊椎動物で、高いゲノム保存の程度、ならびに、細胞の分子および生理学的プロセスの類似性を共有しています。初期の個体発生時には、ゼブラフィッシュの胚は、研究者は、単純な実体顕微鏡を用いて器官の動態を可視化することができ、光学的に透明です。マイクロビーズの注入は、ローカル環境での要因の変化を通じて組織操作を可能にする方法です。これは、研究者が胚内の特定の空間的および時間的ポイントでは、このような分泌ペプチドなどの目的の分子を、シグナル伝達の任意の数の影響を分析することができます。ここでは、詳細初期のゼブラフィッシュの開発中に操作し、インプラントのビーズの方法のためのプロトコル。

操作ツールのいくつかのタイプは、研究用途（ 図1）中にビーズを処理するために有用です。また、小さなウェルを有する単純なアガロースモールドをタイムリーかつ効率的にこれらの実験を行うことが重要であるゼブラフィッシュ胚（ 図1）を保持するために利用することができます。マイクロビーズの注入は、研究者は、目的の分子のための行動の特定のウィンドウを狭くすることを可能にする空間的な位置と目的の一時的な段階で実施することができます。 ここでは、単一のマイクロビーズを、尾芽の段階で、または体節形成の段階で後の時点（ 図3）で、ゼブラフィッシュの胚に移植しました。単独リンゲル液でリンス二つの異なるサイズのマイクロビーズは、このプロトコルのデモ（ 図3A、3Bおよび3C）で使用しました。任意のコンジュゲートの非存在下でのこのマイクロビーズ注入小分子は、ビーズの注入は、ゼブラフィッシュ胚（ 図4）の適切な発達の間に総形態学的影響を与えることなく達成することができることを示しています。 実験者は、胚の上にタングステン針で作られた穿刺孔内にマイクロビーズを操作すると問題が発生することができます。一度、マイクロニードルによって胚上に配置されたマイクロビーズのより良好な取り扱いを実現するために、ウィスカー/ラッシュツールを使用することができます。他の天然または合成ラッシュフィラメントが（ 図1）を利用することができるが、これは、自然にネコやイヌのウィスカーを当てると細工されたことができます。タングステン針またはウィスカーツールのどちらかとマイクロビーズの穏やかなプッシュがマイクロビーズは、金型のリンゲル液に沈む表示されるはずです。マイクロビーズは、タングステン針を使用して、必要であれば、それは大きな距離を移動する必要があり、金型の中に沈んでいるといったん胚の上に針又はウィスカーツールがpositioするために使用することができたら胚にマイクロビーズをn個。ビードが安定した組織内に配置されたままになりますようにマイクロビーズの移植の成功はすぐに、実体顕微鏡で可視化を介して測ることができます。経時ビード位置を評価するために、各胚サンプルを生経時撮影を通して画像化することができ、又は（ 図4に示されるように）ビーズの位置が内因性組織の実験期間にわたってシフトしていないことを確認するために定期的にチェック形態形成。時間をかけてビーズの位置を理解することは、そのような標的組織または発生過程での小分子の影響を評価するような結果、ほとんどの情報に解釈のために重要です。 これらの上記の手順を使用すると、所望の時間と位置にゼブラフィッシュ胚にマイクロビーズを埋め込むに理想的な環境を提供します。我々の経験では、このマイクロビーズ注入プロトコルの初心者ユーザーは、通常のスキルNEを獲得しました練習の約1週間後のゼブラフィッシュ胚にマイクロビーズの一貫した外科的移植を実行するためのcessary。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> 図1.ツールはマイクロビーズの注入を行うために使用される。（A）ビーズ注入トレイ（左、直径15cm）胚の型と（左側）とマイクロビーズのインキュベーショントレイ（右側の、直径6cm）。この作業トレイはマイクロビーズの移植のために所望の向きに胚を配置するために、顕微鏡ステーションで近接して移植のための準備マイクロビーズを持っている研究者を可能にします。マイクロビーズは、顕微鏡ステーションの下に配置されたビード注入トレイにそれらを配置する前に（右）小分子（単数または複数）および/またはビヒクル中でインキュベートした後、独立したマイクロビーズプレート中でリンスすべきです。 （B）微細鉗子2対の蝶理を除去するために使用されますマイクロキャピラリー針の端部を破壊するために、各ゼブラフィッシュ胚を取り囲み、上。 （C）タングステン針がマイクロビーズを配置するにはゼブラフィッシュ胚に非常に微細な穿刺を行うために使用されるであろう。 （D）マイクロキャピラリートランスファーピペットをピックアップし、穿 ​​刺部位付近のゼブラフィッシュ胚の上にマイクロビーズを配置するために使用されます。 （E）ウィスカー/ラッシュツールは、以前にタングステン針で作られた胚内の切開部位にマイクロビーズの穏やかな位置決めが可能になります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> マイクロビーズの移植手順の図2の回路図。（A）マイクロビーズsoakiとマイクロビーズ注入トレイ希望の洗浄溶液中にngのは、実体顕微鏡ステーションの下に設置し、胚組織が上向きに配置されています。 （B）、タングステン針を使用して、胎児への小さな切開は僅かにまだ力強い動きで行うことができます。 （C）マイクロキャピラリートランスファーピペットを用いて、所望のマイクロビーズが右側に位置し、トレイのマイクロビーズのインキュベーションチャンバーから取り出し、そして胚作業領域が位置する左区画にすることができます。マイクロビーズを静かにウィスカー/ラッシュツールを使用して、タングステン針で作られた切開部位に位置し、その後、切開部位の近くに堆積されるべきです。マイクロビーズは、切開部位に操縦されると、それは安定したマイクロビーズを配置し、開発が進むにつれて、胚から後続の動きを防ぐために（離れて切開）から組織内に押し込まれるべきである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>リースこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> 図3.マイクロビーズは、異なる発生段階の胚に移植することができる。（A）ゼブラフィッシュの胚を尾芽段階でトランクにマイクロビーズ（約50μmの直径）を移植しました。 24時間後のビーズインプラント（hpbi）で検査すると、胚が正常に発達したとマイクロビーズは、発生時間の経過の間に最小限の動きを示しました。 3体節期（SS）で卵黄嚢に（約50ミクロンの直径を有する）マイクロビーズを移植した（B）ゼブラフィッシュの胚は、時間の経過とともに、比較的マイナーなビーズの動きと正常な発達を示しました。 （C）拡大マイクロビーズ（約70ミクロンの直径）は、同様に通常のその後の発展だけでなく、ミニを示した7 SS胚に移植しましたMALは、移植部位からの動きが。場合は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> ゼブラフィッシュ胚の図4.総開発は72 hpbi介してマイクロビーズの存在によって乱されていないです。ゼブラフィッシュ胚は7体節ステージ（SS）での（約50μmの直径を有する）リンゲル液に浸したマイクロビーズを移植しました。各マイクロビーズは、外科的に体節3と4の間に、トランクに挿入したビーズの存在は24時間後のビーズインプラントで明白な発達障害（hpbi）、48 hpbi、または72 hpbiと関連しなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。</a>

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K ビュー.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

ビデオ: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

発生生物学

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

ゼブラフィッシュ胚の安定した、動的、および初期の微小管を分析する反応の利用

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

原子間力顕微鏡とゼブラフィッシュ胚の卵黄細胞のレオロジー

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

2 つのサケ科の魚で空気除去の有効性 (オンコルヒュンクス) レインボー ・ トラウトやブラウン ・ トラウト (タイセイヨウサケMorpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

ウサギモデルにおける最適胚期における低侵襲胚移植と胚ガラス化

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...