胚の中では、細胞は互いに相互作用し、化学的および機械的な情報を交換する。これらの相互作用を調査する効率的な方法の 1 つは、いくつかの細胞を殺し、隣接するセルの結果を監視することです。我々が記述する方法は、我々は正確に隣接する組織を損傷することなく、胚内であっても、細胞をアブラ化することができます。
第1レーザーをアブレーション波長820ナノメートルに、2番目のレーザーをmCherryイメージング波長1,160ナノメートルに設定して2光子顕微鏡を用意します。光路上の可動ミラーを使用して、2つのレーザービームを入口と出口に合わせ、820ナノメートルで最初のレーザーの最大出力を測定します。目的の下にパワーメーターを置き、黒い部屋を閉じ、パワーメーターで最初のレーザーパワーを100%スタートデータ収集に設定し、レーザーシャッターを開いて出力電力を測定し、300ミリワットに達するために必要なレーザーパワーの割合を計算します。
1 番目のレーザーを 920 ナノメートルの GFP 励起波長に設定し、電力を 7%に設定して、2 番目のレーザーパワーを 15%に調整して、緑と赤の線の PMT 検出器をアクティブにし、緑と赤の線 PMT 感度を 65 に設定します。視野を 400 x 400 マイクロメートルに、画像解像度を 512 x 512 ピクセルに、スキャン周波数を 800 ヘルツに調整します。3D 時間経過イメージング モードを選択し、フォルダーを作成し、自動保存をアクティブにして、各取得後にデータを保存します。
暖房室を組み立て、摂氏28度に設定します。チャンバーと目標が暖かくなるまで少なくとも10分待ちます。蛍光体型顕微鏡の下で、GFPを発現する70%のエピボリーで胚を同定する。
プラスチック製のパスツールピペットを使用して、アガロースコーティングされた皿の中で3〜4つの選択された胚を移し、慎重に細かい鉗子でそれらをデコール化する。小さなガラスバイアルに、2%アガロースを含むペニシリンストレプトマイシン胚培地の溶液を1ミリリットル加え、42°Cの予熱した乾燥ブロックヒーターにバイアルを入れます。火で磨かれたガラスピペットを使用して、デコリオネート胚をバイアルに移し、アガロースにあまりにも多くの胚培地を加えないように注意する。
残りの胚培地をピペットから捨てます。胚を吸引し、ガラス底皿のスライドを覆うのに十分なアガロースと一緒に戻った。皿のガラススライドに胚でアガロースを吹き飛ばし、胚が空気や皿のプラスチック側に触れていないことを確認します。
その後、ガラススライドの周りのチャンバーをアガロースで満たします。まつげを使用して、ターゲット領域が上部になるように胚を向けます。5分後、アガロースが完全にセットされたら、ペニシリンストレプトマイシン胚培地を数滴加えてガラススライドに加える。
熱い部屋の目的の下にガラス底皿を置きます。チャンバーを閉じる前にペニシリンストレプトマイシン胚培地に目的を浸します。スライダを動かして、光のパスをオキュラーに設定します。
蛍光灯をオンにします。胚を見つけ、その表面に焦点を当てます。蛍光灯をオフにし、ライトパスをPMTに設定してから、黒いチャンバーを閉じます。
ライブイメージングを開始し、軸中軸を見つけます。良い信号を持っている、レーザーパワーを調整します。赤いチャネルを使用して、ステージを胚の最上部に移動し、Z がゼロに等しい位置を割り当てます。
1分のタイムステップと2マイクロメートルのZステップを選択してください。軸中隔の上に15マイクロメートル、軸中隔の下15マイクロメートルで最後のスライスに最初のスライスを設定します。アブレーション前の映画の10〜15分を記録します。
ライブイメージングでは、ポルスター輪郭を見つけ、関心のある電気光学変調器領域、またはEOM-ROIツールを使用して、ポルスターの幅にまたがる20ピクセルの大きさの長方形を描き、長方形をポルスターの真ん中に配置します。高い面と最も低い平面の軸方向の位置を確認し、ROI がどの平面の卵黄セルにも重ならないようにします。退避する Z 位置の最低位置にステージを配置します。
最初のレーザー波長を820ナノメートルに設定し、300ミリワットの出口電力を得るために、先に計算された電力の割合を入力します。イメージング周波数を 200 ヘルツに設定し、最初のレーザーイメージング EOM をゼロに設定します。ROI処理モードを選択した後、EOMをオフにして、ゼロフレームの直後に処理を開始するように設定します。
イメージングモードをTimelapseにして、自動保存を無効にします。時間ステップで高速モードを選択した後、処理フレーム数とフレーム数を、目標とする深さに対応する値に調整します。イメージングを開始します。
EOM治療中にPMTへのシャッターが閉じるので、取得は黒でなければなりません。次に、ステージを次の Z 位置に上げ、同様にアブレーションを実行します。ポールスターの上部に到達するまで、すべての Z 位置で繰り返します。
アブレーションのプロセスが完了したら、最初のレーザーを920ナノメートルに設定し、以前に選択したイメージングパワーに調整します。最初のレーザーイメージングEOMを100にして、フルフィールドモードを選択します。イメージング周波数は800ヘルツにする必要があり、EOMは、すべての平面がアブレートされているかどうかを確認するために、ライブモードでスタック全体を調べる前にオフにする必要があります。
アブレーションが確認されたら、イメージングモードとして3D時間経過を選択します。自動保存を再アクティブ化し、40〜60分間、アブレーション後のムービーの録画を開始します。アブレーション後のムービーで、対象となる細胞が効果的に失われたかどうかを確認します。
ポルスター全体のアブレーションは胚に害を与えてはならないので、アブレートされた胚の正常な形態は受精後24時間で観察することができる。レーザーアブレーションの成功した結果では、重ね合う組織は基礎構造のアブレーションの影響を受けませんでした。あまりにも激しい治療、またはあまりにも少ない治療は、レーザーアブレーションの失敗をもたらしました。
アブレーションが失敗した例は、ポルスターの上の焦点面の自己蛍光破片によって明らかであったポルスターの上の細胞がアブレーションされていることを示しています。別の効果のない試みでは、細胞は漂白されたが、アブレートされなかった、と低蛍光信号はまだ無傷の細胞輪郭を明らかにする。最後に、レーザー治療が不十分なため、一部の細胞は漂白さえされなかった。
気泡の形成は、あまりにも強いレーザー処理によって誘発されるキャビテーションによるものである。Zスタックは、細胞質GFPと核mCherry信号の両方を記録し、成功したアブレーションで40分間毎分捕獲された。さらに、ポルスターの前半分に属する核はマゼンタドットでマークされ、アブレーションの前後に時間をかけて追跡されます。
マイグレーション持続性の尺度として、アブレーション前後の細胞の方向自動相関が検討された。ポルスターの前部に属する細胞は、アブレーションの前に持続的な動きを示し、アブレーション後に大幅に減少し、集団方向移動の喪失を示した。レーザーを適切に調整し、レーザーパワーを測定することは、再現性のある結果を得るために重要です。
また、最初のアブレーション後の画像でアブレーション効率を確認することも重要です。我々は、胚内の細胞の移動を導く細胞と細胞相互作用の役割を疑問視するためにレーザーアブレーションを使用する。しかし、この手順は、細胞や組織を正確にアブレートする必要がある他の多くの質問に簡単に適応することができ、潜在的に生物の深部に置かれる可能性があります。
