このプロトコルは、マイクロコンピュータ断層撮影法を用いて、全臓器スケールで構造病理学的疾患に関する微細構造的洞察を提供する。このプロトコルでは、特殊な組織調製法が実装され、構造疾患の選択的コントラスト増強を伴うヒトにおける翻訳大型哺乳動物モデルからの心臓サンプル全体の高解像度イメージングが最適化される。線維症の分布や興奮性心筋の組織化などの心臓微細構造は、幅広い心臓病の根底にあり、生命を脅かす不整脈の場を設定します。
手順を実演するのは、私の研究室のポスドクで博士号取得者のNestor Pallares-Luponです。まず、ヘパリンナトリウムを含む心筋麻痺溶液を調製し、その溶液を摂氏4度で保存する。次に、まず1リットルの蒸留水にEDTAを10ミリモルの最終濃度で添加してPBS/EDTAを調製します。
次いで、水酸化ナトリウムを用いて溶液のpHを12に上昇させ、維持し、EDTAを溶解する。EDTAが完全に溶解したら、塩酸を使用してpHを7.4に下げます。次いで、PBSの1つのホイルパウチを添加し、pH7.4の0.01モル溶液を得た。
調製した溶液を室温で保存する。最後に、1リットルの無水エタノールに10グラムのPMAを加えて1%エタノールのPMA造影剤溶液を調製する。調製した溶液を室温で保存する。
解剖皿の上に80センチ支持された1リットルの貯水池を用意し、熱可塑性チューブを貯留容器の排水口に結合する。3 方向タップを排水チューブに固定し、さらに熱可塑性チューブを 3 方向タップの各空きポートに結合します。チューブの自由端に双方向タップを固定します。
次に、ヘパリンを添加した心麻痺溶液でリザーバを充填する。蛇口を開けて、心麻痺の溶液がすべての気泡を排出できるようにします。次に、双方向タップを閉じます。
安楽死させた動物から心臓を抽出した後、解剖の準備が整うまで氷上に保存した冷たい心麻痺溶液に入れます。次に、PTFEチューブを5センチメートル切断し、先端を裸の炎の隣に置いて一端を加熱することによって、左右の冠状骨用のカニューレを準備する。先端の1ミリメートルが溶け始め、半透明になったら、先端を硬い耐熱性の表面に押し付けてカニューレ先端に隆起を形成し、カニューレが容器から滑り落ちるのを防ぎ、各カニューレの非加熱端の1センチメートルを排水リザーバ排水チューブの両端に挿入する。
次に、大動脈カニューレを除去し、冷たい心麻痺溶液の下で冠状動脈の左右の骨を局在化させる。尖ったはさみを使用して、冠状動脈骨の上下の周囲の組織から大動脈根を慎重に分離し、冠状動脈血管の下にゼロゲージシルク縫合糸を通すことができるようにする。次に、双方向タップを開き、カニューレの先端を冠状骨に挿入します。
カニューレの先端が骨に1〜2センチメートル伸び、縫合糸の配置を超えて伸びた状態で、カニューレを結びます。次に、心臓の血液がなくなるまで心室を15分間優しくマッサージしながら、心臓をすすぎます。すすぎ後、双方向タップを閉じ、3方向タップから取り外し、500ミリリットルのPBS / EDTA溶液を含む1リットルのプラスチック耐薬品性容器に心臓を移します。
PBS/EDTA溶液をヒュームフードの下の熱可塑性チューブに再循環させ、2つのチャンネルを備えたペリスタルティックポンプを使用します。チューブに気泡がなくなるまでポンプチューブをプライムします。次いで、各冠状動脈カニューレを、室温で毎分80ミリリットルで2時間再循環することによって熟読する。
ヒュームフードが作動可能であることを確認した後、ポンプを停止し、容器から溶液を排出し、10%ホルマリンと交換して、毎分80ミリリットルで1時間固定する。20%エタノールから始めて最低3時間、一連の増分エタノール濃度を使用して心臓を熟読してください。次に、20%エタノールを30%エタノールに交換し、2時間灌流する。
各反復でエタノール濃度をインクリメントし、各濃度で1時間の最小灌流で灌流を継続する。空気乾燥前に心臓組織を強化するために、エタノールとHMDSの等しい混合物を10分間再循環させ、続いて100%HMDSをさらに2時間再循環させる。灌流ポンプを停止し、カニューレをチューブから外し、ヒュームフード内の大動脈縫合糸から心臓を吊り下げる。
ジップロックバッグを心臓の上に慎重にスライドさせ、縫合糸の上のバッグシールを閉じて、循環空気への心臓の暴露を減らします。心臓を1週間蒸発させて乾燥させます。拡散装填造影剤の場合は、袋を取り外します。
100%エタノールで心臓を攪拌しながら15分間洗浄した後、1%PMAを添加した100%エタノールに真空下で48時間浸漬し、前述のようにジップロックバッグで心臓を覆い、乾燥させます。空気乾燥した心臓を適切なサンプルホルダーに取り付けます。X線マイクロCT測定中の動きを防ぐには、サンプルホルダーに固定されたクランプを使用し、乾燥した硬い大動脈を介して心臓を固定します。
サンプルホルダーをマイクロCTスキャナーに取り付けます。次に、ソフトウェアを開き、X線マイクロCTシステムを起動します。次に、X線フィルターのアルミニウムを1ミリメートルに設定します。
X線源電圧は60キロボルト、電流は120マイクロアンペアです。さらに、画像サイズを 2, 016 x 1, 344 ピクセルに設定し、ピクセル サイズを 20 マイクロメートルに設定します。サポートの長さに沿ってX線透過画像をスカウトして、心臓の縦方向アクセスにおける全体的な画像化野を決定する。
スキャンの場合は、360度取得のオプションの選択を解除して、0.18度の回転ステップ、5 つのフレーム平均、および180度のサンプル回転を使用します。オフセット走査モードを選択して、サンプル支持体の全幅を画像化する。スキャン後、等方性3次元画像ボリュームの断層再構成にソフトウェアを使用します。
最終的に偵察ソフトウェアでは、10%のビーム硬化効果と8のリングアーチファクト低減を含む、取得関連のアーチファクト補正を使用します。次に、データ ビューアー ソフトウェアを使用して、再構築されたデータ スタックを視覚化します。画像境界内でサンプルをデジタル的に配向させ、サンプルの長軸と短軸を画像ボリュームの3つの主要な軸に再配置します。
最後に、3 つの軸すべてで画像ボリュームをトリミングして、画像の外側の背景レイヤーを削除し、画像の合計サイズを最大限小さくします。空気乾燥ブタの心臓のX線透過イメージングは、心室腔および筋肉壁を含む主要な解剖学的ランドマークを示す。3次元画像体積の断層画像再構成は、心外膜および心内膜境界における組織と背景との間の明確な分離を示した。
メイソンのトリクローム染色は、心外膜下組織における上皮層および内皮層における傍血管におけるコラーゲン陽性染色を示した。明視野照明は、PMA染色後のコラーゲン構造においてより暗い着色を示し、PMAの優先的蓄積を支持した。心室組織切片のPMA染色蛍光画像は、コラーゲンの部位でPMA誘導蛍光の損失を有していた。
空気乾燥前に灌流を介して造影剤で染色された心臓サンプルの場合、画像再構成は心筋区画内の非常に斑点のある染色を明らかにした。さらに、低コントラスト組織は、バックグラウンド強度からの分離不良を示した。慢性心筋梗塞に罹患しているヒツジの部分のマイクロCT画像化は、緩い不均一な境界ゾーンに囲まれた中枢の高密度線維性病変を明らかにした。
組織境界および瘢痕領域における再構成画像体積の最大の信号強度をここに示す。造影剤は健康な心筋をほとんど染色せず、しかもミクロ構造コントラストは保持されなかった。境界ゾーンでは、瘢痕組織に生き残った心筋が点在していた。
緻密な線維症は、組成の分散を示す経壁的でありながらテクスチャーで現れた。PMA染色組織調製物の経壁左心室領域は、コラーゲンに対する選択的染色を示し、生存心筋の領域では染色を示さなかった。エタノールを使用したより長い灌流時間は、心臓の水分含有量をエタノールと完全に交換するために推奨される。
HMDSと水との相互作用は熱を発生させ、サンプルを損傷する可能性があります。この手順の強力な利点は、組織学を使用してマイクロCTイメージングを検証する能力である。空気乾燥したサンプルは、切片染色、およびマイクロスコープイメージングのためにパラフィンに直接埋め込むことができます。
