このプロトコルは、マウスが自然発作を起こした側頭葉てんかんの新しいモデルを生成し、てんかん発生のメカニズムの調査や新しい治療法のスクリーニングに非常に役立ちました。VGAT-Creマウスにおけるこの手順は、化学痙攣薬または継続的な電気刺激で誘発されたてんかん重積状態の後にしばしば見られる広範な海馬細胞死を引き起こすことなく、自発的な再発性電子および運動および運動複合発作を確実に引き起こす。ヘッドセットの製造を開始するには、長さ3.5センチのポリテトラフルオロエチレンコーティングされたステンレス鋼線を切り取り、ワイヤーの両端から約1ミリメートルの絶縁コートを剥がします。
2本のピンをバイスホルダーに置き、ピンの下部に長いスリットを下に向けてください。次に、ワイヤーの剥がした端とピンの上部にフラックスを塗布します。ワイヤーの剥がされた部分とピンの上部を、側面にオーバーフローせずにコーティングするのに十分なはんだで錫メッキします。
はんだが溶けている間、ワイヤーの剥がした端の1つをピンにできるだけ深く入れます。ワイヤのもう一方の端を剥がした2番目のピンに対してこのプロセスを繰り返します。ピンを冷却して10秒間はんだ付けした後、バイスホルダーからピンを取り外し、ピンを引っ張って、ワイヤーとピンの間の接続がしっかりと保持されていることを確認します。
ピンを冷水ですすぎ、乾燥させます。後で、抵抗計を使用してピン1とピン2の間のコンダクタンスを確認します。ワイヤーの端にあるピンを一緒に持ってきて、平行に保持して閉じます。
止血剤をワイヤーの中心に固定し、止血材を回転させてワイヤーをしっかりとねじります。止血剤を取り外した後、ピンの2ミリメートル下でツイストワイヤーに鉗子を固定して、ワイヤーを90度曲げます。ワイヤーを鉗子の上に90度押し戻し、最初から1ミリメートルでもう1回曲げます。
小さくて鋭いはさみを使用して、撚り線を曲がりの下45度と3.5ミリメートルで切断します。ヘッドセットごとに2つのバイポーラまたはダブルピンツイスト電極を準備します。参照電極を1つ用意するには、両端をピンはんだ付けしたワイヤを2つに切断します。
次に、ワイヤーを7ミリメートルで切断し、ワイヤーの端を先端から1ミリメートル下に曲げます。ワイヤーの曲がった1ミリメートルの先端を鉗子で覆い、ワイヤーを鉗子の周りでしっかりと回転させて、直径1ミリメートルの小さなループを作成します。次に、ループをワイヤーの直線部分に垂直に曲げて、ワイヤーの先端が再び外側を向くようにします。
すべての電極を、2つのバイポーラ電極間の距離を6ミリメートルにして、6ピンの台座に並べて組み立てます。参照電極を中央の外側の穴に配置します。手術を進める前に、8週齢のVGAT-Creマウスの体重を記録します。
次に、動物を誘導室に入れて麻酔を誘発します。麻酔をかけたマウスを摂氏37度の加熱パッドに置きます。フィードバック制御温度システムを使用する場合は、手術中の温度監視のために温度プローブを動物の直腸に挿入します。
手術を開始するには、吸入麻酔の流れをノーズコーンに向け直し、前歯を切歯バーにそっと置き、コーンを鼻に動かして、動物を定位固定装置フレームに取り付けます。次に、イヤーバーを耳に置き、定位固定装置フレームに貼り付けます。動物の頭が水平で中央に配置され、少し調べたときに動かせないことを確認してください。
動物をマウントしたら、水分補給のために0.5ミリリットルのノルモゾールをマウスに注射し、角膜の乾燥を防ぐために眼の潤滑剤を塗布します。後肢の足をつまんで麻酔の深さを監視します。離脱反射が動物に存在しない場合は、手術領域の周りのマウスの頭皮の毛を取り除きます。
完了したら、エタノールとヨウ素を交互に塗布してきれいな皮膚領域を3回消毒し、ヨウ素で仕上げ、0.05ミリリットルの0.25%ブピバカインを皮下注射します。メスを使用して頭蓋骨を切開し、外科用ハサミで皮膚の一部を切り取り、頭蓋骨を露出させます。綿棒で下にあるすべての組織から頭蓋骨をきれいにする前に、皮膚を脇に押します。
滅菌綿棒を使用して過酸化水素で頭蓋骨を洗浄し、頭蓋骨縫合糸、ブレグマ、ラムダを見えるようにします。定位固定マウントドリルを使用して、ドリルチップをゼロのX、Y、Z座標のブレグマに移動します。次に、ドリルを上げてラムダに移動し、その座標を決定して、ヘッドが水平かどうかを判断します。
頭蓋骨を完全に乾燥させた後、アプリケーターでセルフエッチング歯科用接着剤を1滴塗布します。歯科用UVライトで歯科用接着剤を40秒間硬化させる前に、60秒待ちます。光沢のある表面は、接着剤が頭蓋骨と効果的に架橋されていることを示します。
0.031インチのドリルビットの助けを借りて、脳に穴を開けないように、毎分5, 000回転(RPM)で頭蓋骨に両側に2つのバリ穴を慎重に開けます。食塩水を滴下して、バリ穴の穴あけを強化します。海馬の深さの電極の移植のために、ブレグマから3ミリメートル後方と3ミリメートルの外側にドリルで穴を開けます。
ラムダの後ろの小脳の上に、ブレグマから後方6ミリメートル、外側0ミリメートルの参照電極用のバリ穴を1つ開けます。次に、電極を組み立てた6ピン台座を定位固定装置フレームの電極ホルダーに取り付けます。対応するバリ穴の上に電極を合わせることにより、ヘッドセットをゆっくりと下げてナビゲートし、左右の海馬バリ穴の真上に2つのバイポーラ電極チップを配置し、必要に応じて、参照電極を調整して小脳の上の穴の上にホバリングします。
海馬のねじれ電極が穴の真上にある場合は、Z軸をゼロにし、電極を左右の海馬にマイナス3ミリメートルまでゆっくりと下げ、参照電極を小脳の上の穴に導きます。ミキシングボウルで粉末と液体を混合して歯科用セメントを準備しました。次に、頭蓋骨表面、電極、および頭蓋骨表面と台座の下部との間の空間を歯科用セメントで覆う。
セメントが乾いて固まったら、電極ホルダーを定位固定装置アームから取り外し、アームを上げて、ホルダーを台座から取り外します。ケトプロフェンおよびノルモゾールをマウス皮下投与した後、動物を脳定位固定装置フレームから取り外し、動物をビバリウムケージ内の加熱パッド上に移動させる。完全に目覚めたら、単一の動物をビバリウムケージに戻し、動物に柔らかい食べ物を与え、術後最大72時間まで毎日体重減少を監視します。
代表的なバイオリンプロットでは、キンドル状態基準に対するマウスが必要とする刺激の数が示されている。マウスは通常、15回の刺激後にキンドル状態に達するか、5回の両側強直間代運動発作を経験します。自発的反復発作(SRS)の潜時は10.7であり、発作の平均頻度は1日あたり1.3回であった。
信頼性の高いSRS分布は、マウスが約23日間てんかんであることを示した。代表的な画像では、海馬および嗅内皮質の様々なサブフィールドにおける抗NeuN陽性ニューロンまたはニューロン死の数が見られる。2つのバイポーラ電極が2つのバリ穴にスムーズに入ることが重要であるため、バリ穴の真上にある必要があります。
また、電極ホルダーを取り外す前に、歯科用セメントを注意深く塗布し、完全に硬化させることが重要です。この技術により、てんかんマウスを生成し、EEG記録とビデオ記録を同時に使用して継続的に監視することができます。そして、私たちが行う実験により、発作の頻度、期間、重症度を減らすための遺伝子治療などの新しい治療戦略をテストすることができます。
