この作品は、日本学術振興会科研費助成番号 24700349、24659093、25293239、JP18H02536、17 K 07086、文部科学省科研費助成番号 25110737、23110525、アメッド許可番号 JP18ek0109311、洗心医療研究財団と日本によって支えられた部分的てんかん研究の基礎。

すべての実験手順は、動物のケアおよび使用委員会の東京都医科学研究所によって承認されました。生後 8 - 16 週齢のマウスはお勧めします。任意の交は、実験のため許容されます。C57bl/6 マウス BALB/c とスイスのアルビノ マウス、ptz カメラより敏感に対し ptz カメラより耐性があります。C57BL/6 は、この研究で使用されました。Ptz カメラの脆弱性は、マウスの年齢によっても異なります。若いマウスと比較して、古いマウスは、PTZ35より耐火物。このメソッドに使用される動物の数が異なることが、少なくとも 6-10 動物が条件ごとに必要です。
1. PTZ の準備
<ol><li>2 mg/mL PTZ 滅菌 0.9% (w/v) 塩化ナトリウムを溶解します。当日使用の ptz カメラを準備します。</li>
</ol>2. PTZ の注入
<ol><li>9:00 と 12:00 (正午) の間のすべての実験を実行します。</li>
	<li>動物の体重を測定します。</li>
	<li>慣れのため観察室に動物を配置します。</li>
	<li>(3 分) の馴化期間中 PTZ 動物や、以前に決定された投与の体重に基づく注射剤の量を計算します。 注: たとえば、35 mg/kg ptz カメラを使用すると、PTZ の 0.875 mg は 25 グラムの重量を量るマウスに必要な (35 mg/kg × 0.025 kg = 0.875 mg)。2 mg/mL PTZ ソリューションの 437.5 μ L 注入してしたがって、(0.875 mg/2 mg/mL = 0.4375 mL)。PTZ の注入量は、マウスの遺伝子型とひずみに依存します。野生型 c57bl/6 マウス最初の試験、30-35 mg PTZ/kg 体重の投与量を使用することをお勧めします。Ptz カメラの感度は、マウス使用株報36,37に依存します。注射の投与量は、実験の目的によって異なります。</li>
	<li>動物の腹部の左または右の象限に 27 g 針に接続されている 1 mL 注射器で PTZ を腹腔内注入します。正中線に注入することは避けてください。<ol>
<li>同じ位置に繰り返し注射を避けてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PTZ (図 1 a)、投与後 30 分間、動物の行動を観察し、分類スコア異常行動を次のように。可能であれば、特にになったら発作重症度スコア 3 以上は、24 h、または、少なくともさらに 6-10 時間の投与後、観察の下で動物を飼います。<ol>
<li>任意の軽度の発作または 30 分観察期間を超えて動物の行動の変化に注意してください。これは長期観察期間てんかんの慢性のいわれのない発作の世代で PTZ の subconvulsive 線量の特に重要な影響に対処することです。</li>
		<li>さらに、発作の重症度に関連するメジャーな発作期間の変更として各観測発作の発作期間。また、PTZ 注射後最初の発作に待ち時間は、収集するもう一つの重要な指標です。発作頻度、期間、および待機時間を監視、発作後の分子研究のため重要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PTZ の毎日 (図 1 a) を挿入します。注射の数は、実験の目的によって異なります。代表的な例は次のとおりです。<ol>
<li>動物はスコア 5 (強直間代発作) の発作を経験したら、完全に燃やし動物を生成するには、追加の 3 政権内注入を終了します。3 つの連続した政権の奪取のスコアが向上しない場合この場合、注射投与量を増加します。それぞれの動物は異なる番号と PTZ 注射の用量を受信できます。</li>
		<li>PTZ、抗てんかん薬の評価、遺伝子改変マウスの表現型の研究などへの脆弱性を評価するすべての条件の数と PTZ 注入量を修正します。すべての動物に PTZ 注入; の同じ数を与える合計 8 に 12 の注射をお勧めします。動物が死亡した場合発作スコアは 6 として示されるべきであります。</li>
		<li>高発作を維持するために必要な注射の用量を決定するてんかん発作が発生する病理組織学的変化を研究する 10 以上の注射用 (4 または 5) を獲得します。この場合、総噴射数は 25 から 30 の範囲する必要があります。発作スコア 5 に達すると注入量を減らします。発作スコア 3 以下が縮小した場合は、注射投与量を増やします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 発作のスコア
<ol><li>動物の行動を観察し、スコアを記録します。<ol>
<li>分類し、続く38,39 (図 1 b)、てんかんの行動のスコアします。 0: 正常な動作、異常無し。 1: 固定、腹の上に横たわる。 2: 頭うなずいて、顔、前肢または後肢ミオクローヌス。 3: 継続的な全身のミオクローヌス、ミオクロニー ピクピク、尾がかたく開催。 4: 飼育、トニックの奪取、その側に落ちる。 5: 野生急いでとジャンプ、その裏に落ちて、強直間代発作です。 6: 死。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラシーン スコア40、実験の状況に基づく行動基準を変更します。</li>
</ol>4. 発作後分析
<ol><li>今回の分析<ol>
<li>灌流固定<ol>
<li>準備<ol>
<li>4% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を 0.1 M リン酸緩衝液 (7.4) に溶かしてください。約 70 ° C に 1 M 水酸化ナトリウム (50 mL PFA ソリューションの 1 M 水酸化ナトリウム約 1 μ L) のドロップを追加するソリューションを加熱します。</li>
				<li>準備冷えた 4 %pfa とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)。</li>
				<li>針と管の蠕動性ポンプを設定します。残留をクリアするための管を通って約 20 mL の水を実行します。次に、氷冷 PBS で管の開口端を置きます。</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial 血流と固定の脳の準備<ol>
<li>深く小さな瓶で 50 %isoflurane/50% エタノールとマウスを麻酔します。</li>
				<li>仰臥位で、前肢と後肢の先端を固定することでマウスを維持します。</li>
				<li>腹部の腹側正中線をカットし、横隔膜を公開します。</li>
				<li>横隔膜を肋骨の縁に沿ってカットします。その後、リブとボディの両方の側面をカットします。ロックの鉗子で剣状突起をつまみ、胸郭を片脚します。針で固定または鉗子でつまんで、剣状突起の位置を維持します。心を公開します。</li>
				<li>左心室に針を挿入し、はさみを使用して右心房に切れ込み。内部の壁に穴を開けることができると心臓に針をあまりプッシュしないように注意してください。</li>
				<li>(約 15 ~ 20 mL/分) 血液を洗浄するための針を通して氷冷 PBS の着実な流れを開始します。</li>
				<li>体から血液を選択解除すると、泡の添加せず 4% パラホルムアルデヒド溶液 (約 60 mL) にチューブを移動します。灌流を停止します。</li>
				<li>背面の首と背骨を切り取って頭の皮膚とはさみを解剖で頭蓋骨の背の部分をはがします。</li>
				<li>眼窩間属の骨を切り、頭蓋骨の背の部分を完全に削除します。</li>
				<li>後方から jugal 骨と脳の間のギャップを作成し、脳の下に三叉神経と視交叉をカットします。慎重に脳を削除し、4% を含むバイアルに PFA。12-16 h のための 4 ° C で脳を修正後。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>脳スライス標本<ol>
<li>脳に対する凍害保護作用を可能にするソリューションに沈むまで 20% スクロース/PBS に固定脳を転送します。</li>
			<li>必要なスライス方向と脳の必要な部品に基づく固定脳をカットします。</li>
			<li>Cryomicrotome を設定します。位置にブレードをセットし、温度-20 ° C 未満にミクロトーム ステージを維持</li>
			<li>カット済みの脳をステージに配置、20% スクロース/PBS で脳をコートします。スクロース/PBS ソリューションが徐々 にフリーズする、まで脳が完全に冷凍 20% スクロース/PBS で埋め込まれているステージで、脳を覆っています。</li>
			<li>組織をブレードをスライドさせて、脳 (30 μ m 厚) をスライスします。PBS にスライスを転送し、4 ° C でそれらを保つ</li>
		</ol>
</li>
		<li>蛍光免疫組織化学<ol>
<li>0.1% で必要なスライスを洗うトリトン X 100/PBS (PBST) 室温 (RT) で 3 回、10 分間。</li>
			<li>2% ヤギ血清または 5% ウシ血清アルブミン (BSA) に 1-2 時間室温で PBST にそれらをインキュベートし、スライスをブロックします。</li>
			<li>4 ° C で 1 に 7 overnights 2% ヤギ血清または 5 %bsa を用いた PBST の一次抗体の濃度が適切な抗体溶液内のスライスを孵化させなさい</li>
			<li>10 分間、室温 3 回 PBST でスライスを洗う</li>
			<li>光保護 RT で 1-2 時間 PBST で二次抗体の濃度が適切な二次抗体の解決でスライスを孵化させなさい。</li>
			<li>スライド ガラスの上にスライスをマウントし、メディアをマウント、カバーガラスでカバーします。</li>
			<li>蛍光顕微鏡とスライスを観察します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>3 商工会議所テスト<ol>
<li>準備<ol>
<li>少なくとも 2 2-6 ヶ月歳 129/Sv マウス「見知らぬ人のマウス」にマウスとして同性の準備します。分析の前にケージの中のすべてのマウスを慣らします。各トレーニング セッションの檻の中にマウスを置くし、15 分間マウスを残してください。</li>
			<li>件名マウスを使って各慣れのフェーズの前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって全体の器具や両方のケージをきれい。</li>
			<li>3 商工会議所装置の 2 つの側面の部屋で空のケージを置き、部屋間のドアを開きます。</li>
			<li>件名マウスを慣らすしセンター室で件名マウスを置きます、マウスは両方のケージを調査に加えて、ケージを恐れているかもしれない追加 5 分対象動物はありませんまで自由に装置を通して移動するマウスを許可します。20 分のケージを調査し、この分析方法では使用しないでください。そのような動物は、ケージを回避し、ほとんどケージの近くに来る。</li>
			<li>動物センター室に移動後と 5 分センター室を自由に移動マウスの扉を終了します。この期間中にケージに慣らすにケージで 129/Sv のマウスの 1 つを置きます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>社会性解析<ol>
<li>件名マウス馴化期間の直後にこの分析を実施します。</li>
			<li>129/Sv マウスを含んでいるかごを置き「見知らぬ人 1 ケージ」、側面の部屋の 1 つのと呼ばれる「オブジェクト ケージ」、他側の商工会議所でと呼ばれる空のケージを配置します。</li>
			<li>ドアを開き、件名のマウスの動作を監視します。</li>
			<li>10 分間自由に移動し、次の行動のパラメーターを記録する件名マウスを許可します。見知らぬ人 1 ケージを回避し、残りの部屋の 1 つの隅にマウスで示されているように、件名マウスが見知らぬ人 1 ケージ内マウスを恐れて、動物は分析のため使用しないでください。 各商工会議所、見知らぬ人 1 部屋、オブジェクト室内楽、そしてセンター室で) 時間を過ごした。 各ケージ、見知らぬ人 1 ケージおよびオブジェクト ケージの調査にかかった時間 b)。(マウスはマウスをくんくんかいでケージを調べてまたは toughing マウスまたはケージとして分類されます) c) (省略可能) 各商工会議所に入り口の数 d) 総走行距離旅 (オプション)</li>
			<li>マウスのセンター室に移動後、は、ドアを閉じます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>目新しさは社会分析<ol>
<li>社会性解析の直後に、この分析を実施します。</li>
			<li>両方のケージ 70% エタノールで拭いてください。</li>
			<li>「見知らぬ人 2 ケージ」と部屋の 1 つの場所見知らぬ人 2 ケージと呼ばれるケージ内の 1 つの別の 129/Sv マウスを置きます。「見知らぬ人 1 ケージ」と呼ばれる、他のケージで見知らぬ人 1 マウスに、他の部屋で見知らぬ人 1 ケージを置きます。</li>
			<li>ドアを開き、件名のマウスの動作を監視します。</li>
			<li>10 分間自由に移動する被写体マウスを許可し、社会性解析について同じ行動パラメーターを測定します。 注: 1 見知らぬ人と見知らぬ人 2 マウスをランダムに選択する必要があります。見知らぬ人 1 室とオブジェクト商工会議所と同様、見知らぬ人 1 室と見知らぬ人の 2 室は、ランダムに決定する必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>文脈恐怖差別<ol>
<li>ご利用いただけます<ol>
<li>各ご利用いただけます公判前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって実験装置をクリーニングします。</li>
			<li>マウスが、特定の条件でエアコン装置 (装置の形状、壁の色、床材、臭気、照明、バック グラウンド ノイズの音量が事前確認)。たとえば、ここで使用されるエアコン装置だった明確なプレキシ ガラス壁、金属格子床、エタノール臭、100 ルクスの明るさ 65 dB 背景ホワイト ノイズと正方形の装置です。</li>
			<li>0.1 mA 2 の電気ショックの擬似ランダムのタイミングでフット ショックによるマウスの状態 s x 3 倍に 5 分のコースも。</li>
			<li>ご利用いただけます後自宅のケージにマウスを返します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>メモリ評価<ol>
<li>それぞれの評価の前に 70% のエタノールで表面を拭くことによって実験装置をクリーニングします。</li>
			<li>次の日以下のエアコン、ショック状態と同じ装置の上にマウスを置くし、5 分にわたって凍結時間を測定します。</li>
			<li>後で同じ日に装置にマウスを置くし、5 分アセスメント中に凍結時間を測定します。白プレキシ ガラス壁、板の床、臭気、30 ルクスの明るさと 70 dB ホワイト ノイズ三角装置をここで使いました。</li>
			<li>同じ条件と新規の条件の凍結時間を比較します。通常のメモリの能力を持つマウスは、新規の状態でよりも同じ状態でもっと固定されます。凍結は、以上の 2 のための動物の定義された不動 s。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

ここでは、てんかんの薬理学的動物モデルの確立のため広くアクセス プロトコルを提案します。Ptz カメラを介した化学たきは長い歴史を持つ、てんかん41の病理組織学的および細胞の病理学の調査のための一般に受け入れられたモデルです。てんかんの化学的キンドリング モデルは Suzdak とヤンセン、1995年42以前見直されました。薬理学的発作誘導、PTZ、...

てんかんは、慢性神経疾患再発発作によって特徴付けられる、人々 の約 1% に影響を与えます。てんかん患者におけるてんかんと発作の生成の基になるメカニズムは、臨床試験で完全に明らかにできません。したがって、適切な動物モデルがてんかん1の調査のために必要です。
さまざまなてんかん動物モデルは、てんかんの生理学を調査し、抗てんかん薬2,3を識別するために使用されています。これらのモデルの間では、薬理学的発作誘導、てんかん4の病理学の調査のための動物モデルを生成するために使用する一般的な方法です。このメソッドは、安価で簡単です。電極を介したたきは、一般的に使用される方法が、この手順のコストが高いとメソッド反復発作5を誘導する手術や電気のスキルが必要です。
薬理学的誘導は、タイミングと発作の数をコントロールしやすいためにも便利です。自発的な発作を示す遺伝的マウスモデルもてんかんの研究に使用されます。しかし、これらの遺伝的モデルで発作が発生するタイミングと頻度を予測不可能6可能性があります。監視システムは遺伝子改変マウス6のてんかんの行動を観察する必要があります。
カイニン酸、ピロカルピン、pentylenetetrazole (PTZ) は、発作を誘発する薬7として広く使用されます。カイニン酸はグルタミン酸受容体のアゴニスト、ピロカルピンがコリン作動性受容体を活性化します。PTZ は、γ アミノ酪酸 (GABA) の受容体拮抗薬8。PTZ は、神経活動の増加につながる抑制性シナプスの機能を抑制します。この規制は、動物9の一般化された発作を引き起こします。カイニン酸とピロカルピンの単回投与は、急性発作、特にステータスてんかん重積 (SE)10,11を引き起こすことができるおよび慢性特発性と再発発作12を促進するカイニン酸やピロカルピン-仲介された SE,13。 脳波 (EEG) 録音と行動分析が自発的再発性発作が注射12,13の後の月を観察が示されています。PTZ の痙攣投与量の単回投与は、急性発作を誘導します。ただし、PTZ の単一投与後慢性特発性発作は促進するために困難です。PTZ の慢性投与は、反復発作14を誘導する必要があります。いずれかの方法で繰り返し発作の発生は急性発作の世代よりもより類似している人間のてんかんの病理を誘導することができます。PTZ、場合各注射を呼び起こす、発作と発作の重症度は、各注入と段階的により深刻になります。最後に、低用量の PTZ 注射は重度の強直間代発作を誘発します。このフェーズでは、各注入は重篤な発作を連想させます。さらに、発作の待ち時間と実行時間注射のコースに変更もできます。強直発作に待ち時間はしばしば15をたき付けの後者の段階で短くなります。さらに、発作悪化長期発作期間16と一緒に伴われます。発作の重症度を調節する分子メカニズムを解明、待機時間、および期間は、抗てんかん薬17,18,19をスクリーニングするため便利です。
発作は、PTZ の単一の全身投与によって引き起こされる一般的と回復は非常に速く、30 分4,5以内。したがって、発作の数は PTZ キンドリング モデルでより制御可能です。ただし、脳波モニタリングは PTZ を介した発作20後 12 h まで一般化されたスパイクを見ることができることを示しています。したがって、点火機構のより正確な分析のためのまたはミオクロニー強直発作21後 24 時間観察下動物のまま好ましく。
PTZ 注入の前後に抗てんかん薬のエトスクシミド、バルプロ酸、フェノバルビ タール、vigabatrin、retigabine3など管理が発作重症度3,22の悪化を軽減します。 23。同様に、ノックアウト マウス マトリックス マトリックスメタロプロテアーゼ 924などの発作の増悪に関与して欠如遺伝子が、FGF 2225と neuritin26, を使用することを複数の PTZ 注射後減らされた発作の重症度を展示する示されています。さらに、てんかん発作はこのメソッドの後に病理組織学的変化を観察しています。側頭葉てんかん患者、苔状線維が発芽して27,28, 異常な顆粒ニューロン移行29、アストログリオーシス30, 神経細胞のような頭脳で典型的な所見があります。海馬31,32海馬硬化33年死去。同様の変化は、てんかんモデル動物で観察されます。利用可能なメソッドの中で化学的キンドリングの PTZ を介したはてんかん動物モデルを生成する、再現性のある良いと安価な方法です。ピロカルピンを介した SE モデルで発作のコントロールが難しく、多くのマウスが死ぬか SE34を開発する失敗します。対照的に、死亡率と発作の重症度は、PTZ モデルでより制御されます。また、PTZ、カイニン酸よりも安価、マウス脳外科のスキルは薬剤の投与は必須ではありません。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pentylenetetrazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>MANAC</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>CLEA Japan</td>
			<td></td>
			<td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle(27G x 3/4&#34;) (0.40 x 19 mm)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scale</td>
			<td>Mettler</td>
			<td>PE2000</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&#38;D company.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristatic pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>30404-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-700</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-synaptoporin antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>102 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZnT3 antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>197 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-doublecortin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contextual fear discrimination test apparatus</td>
			<td>O&#39;hara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three chamber test apparatus</td>
			<td>Muromachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Pentylenetetrazole (PTZ) は、GABA 受容体の拮抗薬です。Subconvulsive 線量の連続注射化学たき、てんかんモデルの開発に使用されているに対し、動物に PTZ の腹腔内投与は高用量で急性、重症発作を誘発します。PTZ の低用量注射なし痙攣発作を誘発します。ただし、PTZ の繰り返し低用量注射はけいれん発作を引き起こす閾値を低下します。最後に、PTZ の連続の低用量投与は重度の強直間代発作を誘発します。このメソッドは、単純なてんかんのけいれん発作を反復を含む慢性疾患として定義される病態の調査に広く適用できます。プロトコルをたきこの化学物質は、動物の反復的な発作を引き起こします。この方法では、ptz カメラを介した発作やてんかん発作の悪化の程度への脆弱性が推定されました。これらの利点は、抗てんかん薬、てんかん関連遺伝子をスクリーニングするためのこのメソッドの使用につながっています。さらに、このメソッドは、てんかん患者の脳の組織学的変化は、化学焚かれ動物の脳にも表示されますので、てんかん発作後神経損傷を調査する使用されています。したがって、このプロトコルは、便利なてんかんモデル動物の作成に便利です。

PTZ の反復注射は、発作の重症度の増加を誘導します。6 c57bl/6 マウスを施した PTZ と別の 6 マウスは対照群として生理食塩水で扱われました。PTZ 投与量は 35 mg/kg と 10 注射を投与します。発作のスコアは、発作や異常行動を生理食塩水注射 (図 2) でない誘発したに対し、PTZ 注射で徐々 に増加。ボンフェローニ テスト続く分散分析は、PTZ 投与群?...

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Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

このプロトコルは pentylenetetrazole と化学的キンドリングの方法を記述しててんかんのマウス モデルを提供します。このプロトコルはマウスのてんかん発作後発作誘導と病態への脆弱性を調査するも使用できます。

Pentylenetetrazole 誘起キンドリング マウス モデル

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

pentylenetetrazole-induced-kindling-mouse-model

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Pharmacotherapy of the Epilepsies

SCIENTISTS IN ACTION

32.2K ビュー.  Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. このプロトコルは pentylenetetrazole と化学的キンドリングの方法を記述しててんかんのマウス モデルを提供します。このプロトコルはマウスのてんかん発作後発作誘導と病態への脆弱性を調査するも使用できます。

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Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

神経科学

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

アルツハイマー病のマウスモデルにおける神経突起斑の検出

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

マウスモデルにおける静脈内自己投与方法

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

トリプシン消化プロトコルモデルマウスの網膜血管系を分析する

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

多発性硬化症のマウスモデルで進行性の神経障害を測定します

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

新生児低酸素性虚血性脳損傷のマウス モデルにおける神経行動学的評価

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

生体内でマルチ モーダル イメージングとマウス レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

萌芽期の神経を研究するためのモデルとしてのマウス脳

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique VGAT-Cre mice were used in developing spontaneous recurring seizures (SRS) after kindling and a likely mechanism - insertion of Cre into the VGAT gene - disrupted its expression and reduced GABAergic tone. The present study extends these observations to a larger cohort of mice, focusing on key issues such as how long the SRS continues after kindling and the effect of the animal's sex and age. This report describes the protocols for the following key steps: making headsets with hippocampal depth electrodes for electrical stimulation and for reading the electroencephalogram; surgery to affix the headset securely on the mouse's skull so that it does not fall off; and key details of the electrical kindling protocol such as duration of the pulse, frequency of train, duration of train, and amount of current injected. The kindling protocol is robust in that it reliably leads to epilepsy in most VGAT-Cre mice, providing a new model to test for novel antiepileptogenic drugs.

This report describes the methods to generate a model of temporal lobe epilepsy based on the electrical kindling of transgenic VGAT-Cre mice. Kindled VGAT-Cre mice may be useful in determining what causes epilepsy and for screening novel therapies.

側頭葉てんかんモデル作製のためのVGAT-CREマウスの電気的キンドリング電極の作製と移植

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Pentylenetetrazole 誘起キンドリング マウス モデル

Pentylenetetrazole 誘起キンドリングマウスモデル